聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-wenkub
2023-06-10 18:12:00 本頁面
【正文】 PCR擴增產(chǎn)物的量就大，因此對于大分子 量的模板 DNA（ 尤其是真核生物基因組 DNA）， 在擴增之前最好先 用超聲波處理或限制性酶消化 。 UITma DNA聚合酶（ Thermotoga maritima） DNA聚合酶的使用 DNA聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 1 5 Units / mL 特異性的改進： 在建議使用的范圍內(nèi)盡可能地降低酶濃度。 Tth DNA聚合酶在較高的溫度下仍具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此 能很 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Pfu是一種 高保真 的 DNA聚合酶，出錯率極低； Pfu DNA聚合酶擴增出的產(chǎn)物帶有平頭末端； Pfu DNA聚合酶擴增速度極快，達(dá) 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶（ Pyrococcus furiosus） Pfu DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性很高。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使 Taq酶的 聚合出錯率降低到原來的 1/3。 PCR擴增反應(yīng)的精確性 2 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的使用 PCR擴增反應(yīng)的精確性 利用 PCR技術(shù)擴增 DNA靶序列的一個重要問題是這種 DNA體外聚 合反應(yīng)的序列忠實程度，即 DNA擴增產(chǎn)物序列的 準(zhǔn)確率 。5 2 3 4 1 6 7 8 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 PCR的模板及制備 PCR的引物設(shè)計及合成 PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù) PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 1 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的基本原理 PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo) PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又稱為 PCR 擴增技術(shù) ，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 PCR反應(yīng)的 準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)的 DNA聚合反應(yīng)，除了缺少完善的 DNA聚合校 正系統(tǒng)外，影響 PCR反應(yīng) 準(zhǔn)確率的因素還包括： DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA鏈的物理損傷 PCR反應(yīng)體系的潔凈度 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性，它 負(fù)責(zé)對錯誤摻入的堿基進行校正。 Taq DNA聚合 酶催化的聚合反應(yīng)的普遍 則 Taq DNA酶還常常導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的缺失突變。 X 10–7 X 10–6 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Vent DNA聚合酶具有 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性和校正功能，因此 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對較好的高保真性，其 出錯率為 X 10–5 X 10–5 ； Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） 度小于 2 kb時，擴增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 聚合酶的濃度是決定 PCR反應(yīng)成本的 的重要參數(shù)，濃度 過高不僅能降特異性，同時也導(dǎo)致不必要的消耗。 PCR引物的設(shè)計原則 4 PCR的引物設(shè)計及合成 PCR引物的使用 引物的在線設(shè)計工具及免費軟件簡介 PCR引物的設(shè)計原則 選擇合適的引物是 PCR實驗設(shè)計的重要步驟，合適引物最基本的 引物的長度 標(biāo)準(zhǔn)就是與靶序列的 高特異性雜交 。如果兩條引物的退火溫度差別過大，可以適當(dāng)延長 較低 Ta值 的引 物的 3’ 端（這樣可以保持?jǐn)U增產(chǎn)物的長度不變）或 5’ 端。 盡可能高的互補程度是必要的。 引物的在線設(shè)計工具及免費軟件簡介 The Primer Generator（ TPG） TPG是一種基于 CGI數(shù)據(jù)庫便利的用于定點突變的引物設(shè)計工具。而且能根據(jù)三種計 算方法顯示正反向引物的 Tm值，可以隨意更換堿基以提高或降低 Tm值 同時還能提供引物穩(wěn)定性的參數(shù)，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、引物相 似性等。 對的堿基，則適當(dāng)降低引物的濃度。 準(zhǔn)確性的改進： 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 也應(yīng)同步降低。因此， PCR反應(yīng)系統(tǒng)的 主要優(yōu)化參數(shù) 是 Mg+2的濃度，尤其當(dāng)擴增產(chǎn)物大 大于 1kb時，這個因素顯得更為重要。不同 DNA聚合酶所擁有的 Tm值的差異 會改變有效的引物退火溫度。較長 PCR產(chǎn)物的擴增需要相應(yīng)延長反應(yīng)時間，但最好要 比理論計算時間更長些，以彌補由于反應(yīng)系統(tǒng)粘度增大所產(chǎn)生的反 應(yīng)滯后作用。 反應(yīng)體積 反應(yīng)體積 的標(biāo)準(zhǔn)范圍： 20 100 ml（ ml的小離心管 ） 有效性的改進： 增加反應(yīng)體積以及保溫時間，以充分保證熱平衡； 5 ml的反應(yīng)體積也有成功的例子。兩種酶的配比如下： 其中， Pfu和 DeepVent起著二次校對的作用。 不對稱 PCR中的兩條引物濃 度一般采用 50100∶ 1的配比， 在最初的 10 15個循環(huán)中，主要 產(chǎn)物還是雙鏈 DNA， 但當(dāng)?shù)蜐舛? 的引物耗盡后，高濃度引物引導(dǎo) 的 PCR反應(yīng)便會產(chǎn)生大量的單鏈 原位 PCR（ In Situ PCR） 原位 PCR
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