氨基酸組成分析ppt課件-wenkub
2023-05-16 04:16:17 本頁(yè)面
【正文】 析氨基酸，主要采用乙酰 化氨基酸在硅膠柱上或?yàn)V紙上半定量；隨后， Moore、 Stein應(yīng)用離子交換柱直接分離游離的氨基酸，在 1958年， Spackman、 Stein、 Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析 儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段，至今仍是 經(jīng)典的方法。第三章 氨基酸組成分析 氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子質(zhì)量在 75～ 200Da之間，其化學(xué)通式為 RCH(NH2)COOH，在生物體 內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是 L型，僅在少數(shù)微生物來(lái)源的多肽中出 現(xiàn) D型氨基酸。 第一節(jié) 氨基酸組成分析的目的 現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操作微量化，但也給 定量帶來(lái)了困難，一般很難通過(guò)常規(guī)的稱量或測(cè)蛋白質(zhì)溶液 在 280nm的光吸收值來(lái)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的水解方法 氨基酸分析的第一步是將蛋白質(zhì)或多肽水解，常規(guī)方法是采用 ℃ 水解 24h，也有在 150℃ 下快速水 解 90min。其中，苯酚是作為一種抗氧化劑來(lái)防止半胱氨酸 (Cys)和甲硫氨酸 (Met)的氧化。在實(shí)驗(yàn)中 通常采用一些標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素 c(Cyt c)、核糖核酸 酶 (RNase)或胰島素 (insulin)為標(biāo)樣進(jìn)行水解、衍生和色 譜分析來(lái)計(jì)算回收，從而考驗(yàn)蛋白質(zhì)分析的可靠程度和評(píng)價(jià) 方法的適用性。 這些添加劑包括琉基乙酸和 β琉基乙醇，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn) 認(rèn)為液相水解時(shí)加入巰基乙醇對(duì) 色氨酸 保護(hù)效果較好，色氨 酸的回收可達(dá) 80％。 4．酶 蛋白酶水解法有時(shí)也有應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，對(duì)天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均無(wú)破壞作用，但酶水解法往往不完全，必須用酸水解法 校正。 雖然蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析法對(duì)大多數(shù)氨基酸是快速、準(zhǔn)確和靈 敏的，但在半胱氨酸定量時(shí)仍遇到很大困難，解決這個(gè)問(wèn)題的途徑有兩 種，一種是還原烷化法，另一種是氧化法。 (2)氧化法 氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸，過(guò) 甲酸氧化反應(yīng)的缺點(diǎn)是它會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸 會(huì)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。另外，在膜上做氨基酸 組成分析時(shí)可以做一個(gè)空白對(duì)照，具體操作時(shí)將含蛋白條帶的 PVDF膜 割下，另取一條相同面積
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