【正文】 第二章 關(guān)于生物制藥技術(shù) 第一節(jié) 生物技術(shù)在制藥工業(yè)中的應(yīng)用 第二節(jié) 生物制藥技術(shù)概論 第三節(jié) 基因工程技術(shù) 第四節(jié) 原生質(zhì)體融合技術(shù) 第一節(jié) 生物技術(shù)在制藥工業(yè)中的應(yīng)用 ? 一：酶蛋白抑制劑 二：基因工程藥物 三：動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá) 四：基因重組疫苗 五：基因治療藥物 ? 現(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程四大類。 ? 基因工程藥物又涉及到酶蛋白抑制劑、基因重組疫苗、單克隆抗體、基因治療藥物 。 一：酶蛋白抑制劑 ? 不同的酶抑制劑可用于治療許多不同的疾病。 （ 1）蛋白酶抑制劑可治療腫瘤、氣腫病。 （ 2）角鯊烯合成酶抑制劑可降低膽固醇。 （ 3） 3羥基 3甲基 戊二酰輔酶 A膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移（ 4）酶抑制劑治療高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化。 （ 5）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可治療高血壓。 （ 6）糖苷水解酶抑制劑可治療糖尿病、高脂蛋白血癥、肥胖癥。 （ 7）磷酯酶抑制劑可治療胰腺炎。 二：基因工程藥物 ? 基因工程藥物著眼于整個(gè)基因組，其方法是讓目的基因在一個(gè)體外系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，再經(jīng)過分離純化，來生產(chǎn)藥物。 基因工程有以下分類： 1：細(xì)菌基因工程 2：哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程 3：哺乳動(dòng)物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程 4：哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器工程 1：細(xì)菌基因工程 ? 把目的基因?qū)氲郊?xì)菌中，通過目的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，來生產(chǎn)藥物。 ? 細(xì)菌基因工程的缺點(diǎn)： （ 1）由于細(xì)菌是低等生物，有時(shí)不能轉(zhuǎn)錄和翻譯所導(dǎo)入的基因，或者所表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏生物活性。 （ 2）細(xì)菌工程藥物的生產(chǎn)需要一個(gè)很大的發(fā)酵車間，其生產(chǎn)成本較高。 2：哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程 ? 通過培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，將目的基因?qū)氲絼?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，用來生產(chǎn)動(dòng)物或人所需要的蛋白質(zhì)藥物。例如：人凝血因子 1X就是通過動(dòng)物細(xì)胞工程生產(chǎn)的。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 藥物對(duì)于人體來說具有較大的組織相容性。 ? 缺點(diǎn)： （ 1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件十分苛刻。 （ 2）生產(chǎn)成本較高 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 1974年， Jaenish和 Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了 AV40 DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。 Palmiter等人于1982年將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥小? 3：哺乳動(dòng)物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程 ? 這種方法實(shí)際上就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用，將目的基因?qū)氲絼?dòng)物的受精卵中，與染色體 DNA整合，從而形成穩(wěn)定的遺傳性。 ? 目前，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥用蛋白有： （ 1）抗凝血酶 III、 （ 2） a1抗胰蛋白酶、 （ 3）血紅蛋白、 （ 4）乳鐵蛋白、 （ 5）磷脂蛋白、 （ 6）長(zhǎng)效 tpA、 （ 7）生長(zhǎng)激素。 如美國 Genzyme公司培育出的 tpA轉(zhuǎn)基因山羊，每知羊奶中 tpA的含量最高可達(dá) 100克。 ? 優(yōu)點(diǎn) 能夠持續(xù)不斷地獲得轉(zhuǎn)基因藥物。 哺乳動(dòng)物的基因動(dòng)物克隆技術(shù) 4：哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器工程 ? 最理想的是將基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物的乳腺細(xì)胞，形成哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器，最后從動(dòng)物的乳腺中獲得基因藥物。 ? 目前，從轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中可以獲得含有 （ 1）人白蛋白、 （ 2）乳鐵蛋白、 （ 3）纖維蛋白源、 （ 4）抗凝血酶等等基因藥物。 ? 英國羅斯林研究所的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有 a1抗胰蛋白酶，可用來治療囊性纖維化肺病、肺氣腫。 哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器工程優(yōu)點(diǎn) （ 1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時(shí)也容易提純。 （ 2）乳腺是一個(gè)外分泌器官，乳汁不會(huì)參與體內(nèi)循環(huán)，也不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身的生理代謝過程。 （ 3）乳汁所表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾加工之后，具有穩(wěn)定的生物活性。 （ 4）對(duì)于牛、羊這些大量分泌乳汁的動(dòng)物來說，動(dòng)物本身就相當(dāng)于一座大型的藥物工廠。 三：動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá) ? 動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá)就是植物生物反應(yīng)器。 ? 隨著基因工程研究技術(shù)的不斷深入，國外已經(jīng)有十幾種動(dòng)物性的蛋白質(zhì)、多肽可以在植物中表達(dá)。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例 動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá)中的優(yōu)缺點(diǎn) 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 1） ? 乙肝病毒表面抗原（ HBsAg）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸素菜 B亞基（ LTB）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 諾沃克病毒外殼蛋白（ Norwalk virus）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 蓋氏 13單克隆抗體（ Guys` 13 mAb）在植物中轉(zhuǎn)基因 預(yù)防齲齒 ? 谷氨酸脫羧酶（ GAD）在植物中轉(zhuǎn)基因 預(yù)防糖尿病 ? 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（ GMCSF）在植物中轉(zhuǎn)基因 預(yù)防感染 ? Leu腦啡肽（ LeuEnkephalin）在植物中轉(zhuǎn)基因 鎮(zhèn)痛。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 2） ? 水蛭素（ Hirudin）在植物中轉(zhuǎn)基因 凝血酶抑制因子 ? 表皮生長(zhǎng)因子（ EGF）在植物中轉(zhuǎn)基因 刺激上皮細(xì)胞分裂 ? 促紅細(xì)胞生成素（ EPO）在植物中轉(zhuǎn)基因 調(diào)節(jié)紅細(xì)胞水平 ? 紅鱒生長(zhǎng)激素（ Growth hormone）在植物中轉(zhuǎn)基因 刺激生長(zhǎng) ? 人血清白蛋白（ Human serum albumin）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 人干擾素（ HIFNaD）在花椰菜花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 抗病毒 ? a天花粉蛋白（ atrichosantin）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 抑制艾滋病病毒。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 3） ? 血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ ACEI）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 抗過敏反應(yīng) ? 流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原（ HIV1gp120）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 瘧疾抗原在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 口蹄疫病毒抗原和象鼻病毒抗原（ HRV14）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 水貂腸炎病毒抗原（ MEVVP2）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 犬細(xì)小病毒抗原（ CPVCPVP2）在李痘病毒中轉(zhuǎn)基因。 2：動(dòng)物基因在植物中的表達(dá)中的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （ 1）可以減少純化過程而大降低了成本， （ 2）通過植物生物反應(yīng)器方式，人們只須通過吃水果、蔬菜等方式來替代打針、吃藥。 （ 3）將植物生物反應(yīng)器與植物的組織培養(yǎng)結(jié)合起來，就可以在組織培養(yǎng)車間生產(chǎn)有價(jià)值的轉(zhuǎn)基因藥物。 缺點(diǎn)： 外源蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)水平還不高。 四：基因重組疫苗 基因疫苗的生產(chǎn)方法 基因疫苗的種類和特征 基因疫苗的優(yōu)缺點(diǎn) 1990年 9月 14日 ， 美國國立衛(wèi)生研究院 （National Institutes of Health, NIH） 正式批準(zhǔn)安德生 （ W. F. Anderson）領(lǐng)導(dǎo)的治療小組為一位因腺苷脫氨酶 （ADA） 基因缺陷而出現(xiàn) 嚴(yán)重綜合性免疫缺陷癥 （ SCID） 的４歲女孩作基因治療 。安德生采用白細(xì)胞培養(yǎng) ， 以帶正常 ADA基因的病毒感染白細(xì)胞 ， 再將白細(xì)胞注入體內(nèi) 。 到 1991年 5月 ， 經(jīng) 7次注射 ， 患兒體內(nèi) ADA水平達(dá)到正常人的 25％ ， 免疫功能逐漸恢復(fù) 。 基因疫苗的生產(chǎn)方法 ? 基因疫苗又稱核酸疫苗、也稱為裸 DNA疫苗，其方法是： （ 1）將編碼某種搞原蛋白的外源基因克隆到真核質(zhì)粒之中。 （ 2）將這種質(zhì)粒作為疫苗注射到動(dòng)物體內(nèi)。 （ 3）質(zhì)粒的 DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生蛋白質(zhì)成為抗原，激活動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。達(dá)到免疫的目的。 基因疫苗的種類和特征 ? 目前，基因疫苗在治療流感病毒、乙型肝炎、結(jié)核病、瘧疾、狂犬病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、艾滋病、干細(xì)胞淋巴瘤、腦炎病毒等等方面已經(jīng)進(jìn)入研發(fā)階段。 ? 基因疫苗的特征： （ 1）基因疫苗既具有預(yù)防作用、又具有治療作用。 （ 2）既能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，本身又具有免疫作用。 基因疫苗的優(yōu)缺點(diǎn) ? 基因疫苗的優(yōu)點(diǎn)： （ 1）基因疫苗的抗原結(jié)構(gòu)接近天然構(gòu)象。 （ 2）抗原性強(qiáng)。 （ 3）生產(chǎn)成本低。 ? 基因疫苗的缺點(diǎn)： 急需解決的是轉(zhuǎn)基因生物安全性問題，必須保證質(zhì)粒 DNA不與宿主動(dòng)物發(fā)生基因整合，以防止后代發(fā)生致畸作用和出現(xiàn)遺傳病。 五：基因治療藥物 ? 帕金森氏病的患病原因是由于大腦喪失了產(chǎn)生多巴胺的細(xì)胞，其理想的替代來源是人體的胎兒組織，然而這種細(xì)胞的來源十分有限。 ? 為此人們開始研究動(dòng)物的胎兒細(xì)胞。通過基因重組技術(shù)，克隆牛的多巴胺生成細(xì)胞到大鼠體內(nèi)，以期望能夠大量生產(chǎn)多巴胺。 第二節(jié) 生物制藥技術(shù)概論 ? 一：從 DNA→mRNA→Pr ? 二：細(xì)胞破碎技術(shù) ? 三：提取技術(shù) ? 四：分離純化技術(shù) ? 五：滅菌技術(shù) ? 六：干燥技術(shù) ? 七：基因工程原理 一：從 DNA→mRNA→Pr ? 1： DNA的半保留復(fù)制 ? 2： DNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA ? 3： mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 DNA ? 4： mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì) ? 5：蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的加工和修飾 二：細(xì)胞破碎技術(shù) （一）物理方法 （二）化學(xué)方法 （三）新型技術(shù)和方法 （一）物理方法 1：研磨法 細(xì)胞在玻璃球、或者鋼球之間被碾碎。 2：搗碎法 在韋林氏