11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程(已修改)
2025-08-28 02:05 本頁面
【正文】 第七章 酶的蛋白質(zhì)工程 現(xiàn)代酶工程的要求 ? 能具備長期穩(wěn)定性和活性 ? 能適用于水及非水相環(huán)境 ? 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 ? 能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料 途徑 方法 優(yōu)點(diǎn) 不足 酶分子改造 核酸水平 蛋白質(zhì)工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性 操作復(fù)雜，周期長 蛋白質(zhì)水平 化學(xué)修飾 適應(yīng)所有酶，操作簡單經(jīng)濟(jì) 修飾過程破壞酶分子 劑型 固定化 適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn) 載量較低，易失活 交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高 成本高 微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡單、經(jīng)濟(jì) 工作量大 反應(yīng)介質(zhì) 適用于特殊反應(yīng)體系和酶類 適合的酶類還不普遍 改進(jìn)酶性能的方法 蛋白質(zhì)工程概念： 是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計和改造。 二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)依賴于其所含的氨基酸序列 , 而氨基酸的序列又由其編碼基因的核苷酸序列所決定。 因此按預(yù)定方案通過對編碼該蛋白質(zhì)基因的改造，就可以獲得新型的蛋白質(zhì)分子 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定 一級結(jié)構(gòu)測定： ?直接法： 直接測定多肽鏈的氨基酸順序。 ?間接法： 從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 三級結(jié)構(gòu)測定： ?X射線晶體衍射 —— 研究處在 晶體狀態(tài) 下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) ?核磁共振 (NMR)光譜 —— 研究處在 溶液狀態(tài) 的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 三、蛋白質(zhì)工程的主要手段 蛋白質(zhì)工程的長遠(yuǎn)目標(biāo)是創(chuàng)造人類所需要的各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。 但目前主要是通過基因突變手段以制取天然蛋白質(zhì)的各種人工突變產(chǎn)物。 以重組 DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。 位點(diǎn)特異性突變 — 基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué) 基因突變 隨機(jī)突變 —— 基于高通量篩選法 基因剪接 基因內(nèi)部的剪接 5‘或 3’端的剪接 ? 定點(diǎn)突變（ 酶分子的理性設(shè)計 ） ? sitedirected mutagenesis ? 酶分子基因序列中特定位點(diǎn)引入突變，這種突變包括特殊堿基的添加、刪除、取代等。通過改變特定氨基酸來獲得突變體酶，以改變天然酶的催化活性、底物特異性或穩(wěn)定性。 ? 由于定點(diǎn)突變首先獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)有功能之間的關(guān)系等信息，在此基礎(chǔ)上找出需要改造的部位，進(jìn)行酶分子的設(shè)計和改造，因此這種改造稱為酶分子的理性設(shè)計。 合理設(shè)計的技術(shù)需求 三類專家： ①蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定的專家； ②蛋白質(zhì)分子設(shè)計的專家； ③基因工程的專家。 空間結(jié)構(gòu)測定的專家： 主要應(yīng)用 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的方法與技術(shù)對蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行實驗測定。 分子設(shè)計專家： 在了解了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后，主要通過理論的方法，提出蛋白質(zhì)改性的設(shè)計方案，這一方案將提供改性后的蛋白質(zhì)哪些部分的氨基酸順序與天然蛋白質(zhì)不同，這些新的序列可以導(dǎo)致怎樣的空間結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的變化，從而能賦予新蛋白質(zhì)什么樣的特性。 當(dāng)前的分子設(shè)計主要以能顯示圖形圖象的計算機(jī)為工具，采用基于物理學(xué)原理的各種模擬方法和基于蛋白質(zhì)的改性分子結(jié)構(gòu)知識的模型構(gòu)建方法，或兼用這兩類方法。 基因工程專家： 在得到了新的蛋白質(zhì)的改性設(shè)計方案之后，就用一套分子生物學(xué)的技術(shù)，先合成相應(yīng)的基因模板，再經(jīng)過克隆與表達(dá)，得到新蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，最后通過分離、純化，提取出足夠純的新蛋白質(zhì)以研究它的性質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程的這一程序不是一次就能實現(xiàn)的，往往要經(jīng)過多次的循環(huán)，不斷改進(jìn)設(shè)計方案才能發(fā)現(xiàn)一個理想的新改性蛋白。 ? 酶定點(diǎn)突變常用技術(shù)： ? 1. 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 ? 2. PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 ? 3. 盒式突變 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 盒式誘變 注意事項 ① 改造對象有沒有測定出空間結(jié)構(gòu)。如果沒有測定出空間結(jié)構(gòu)，有沒有同源蛋白的空間結(jié)構(gòu)，如果都沒有，那就很難進(jìn)行以后的分子設(shè)計。 ② 結(jié)構(gòu)和生物功能的聯(lián)系是否明確。有些蛋白質(zhì)雖然已經(jīng)測定了空間結(jié)構(gòu)，但其功能部位在哪里還不肯定，這樣的對象改造起來也有一定的盲目性。 ③ 所選對象的重要性。衡量的標(biāo)準(zhǔn)是看它可能導(dǎo)致什么樣的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。 ④ 是否易于進(jìn)行分子設(shè)計和最后的基因工程生產(chǎn)。 酶的定向進(jìn)化 1993年 ,美國科學(xué)家 Frances H Arnold （ 加州理工大學(xué) ， 生物化學(xué)家 ） 首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念 ， 并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶 。 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出 人為地創(chuàng)造
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