【正文】 檢驗技術(shù)資格考試考點精要——微生物學(xué)檢驗（中級）1. 生物學(xué)按界門綱目科屬種分類，種是最小單位。病毒分類：目、科、亞科、屬、種。屬名VRirus結(jié)尾的單詞,亞科名VRirinae結(jié)尾的單詞,科名VRiridae結(jié)尾的單詞。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分為：73個科、11個亞種、289個屬。2. 結(jié)核菌可利用甘油為碳源，梭狀芽胞菌可以氨基酸為碳源，流感嗜血桿菌要Ⅴ，Ⅹ因子才能生長。3. 藥物敏感試驗：紙碟法、小杯法、凹孔法、試管法。常用單片紙碟法、試管稀釋法（以抗菌藥物的最高稀釋度仍能抑制細(xì)菌生長或殺菌管為終點，該管含藥濃度為最低抑菌濃度MIC或最低殺菌濃度MBC），兩值越低則表示越敏感。MIC與抑菌圈呈負(fù)相關(guān)，即抑菌環(huán)直徑越大，MIC越小。各藥敏紙片間距不少于24mm，距平板內(nèi)緣不小于15mm。藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn) ：抑菌圈直徑（毫米）：20以上極敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。 多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。：酶免疫技術(shù)（EIA）、協(xié)同凝集試驗、免疫熒光技術(shù)（IF）、對流免疫電泳（CIE）、免疫印跡技術(shù)。：核酸雜交、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)。PCR技術(shù)—是選擇DNA或RNA體外擴(kuò)增技術(shù)，用標(biāo)本提取DNA為擴(kuò)增模板，選用一對特異寡核苷酸為引物，PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，經(jīng)不同溫度變性9394℃（作用1min氫鍵斷裂形成單鏈DNA）、退火4060℃（迅速冷卻3060s引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈）、延伸7075℃（在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四種脫氧核苷酸為原料，從引物5’→3’端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。），擴(kuò)增產(chǎn)物用溴乙啶染色的凝膠電泳。其具有特異、快速、靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡便、能夠定量。引物是PCR特異性的決定因素，PCR反應(yīng)中TaqDNA聚合酶、引物加量過多，可引起非靶序列擴(kuò)增。變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變： 1）溶液粘度降低。2）溶液旋光性發(fā)生改變。3）增色效應(yīng)。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為 退火，Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。核酸實驗中經(jīng)常以迅速冷卻至4℃以下方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。基因芯片技術(shù)（DNA芯片、DNA微陣列）—主要過程：DNA微陣列的制備、樣品的制備、靶分子和探針之間的雜交、雜交信號的檢測與分析。具有快速、敏感、高通量檢測平臺。核酸雜交（基因探針雜交技術(shù)）是指單鏈RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根據(jù)堿基配對原則，借氫鍵相連而形成雜交分子的過程。雜交百分率＞70%（≥69%）為高度同源性，同源性在60%以上是一個種，同源性在60%70%是同一種內(nèi)不同亞種，同源性在20%60%同一屬內(nèi)不同菌種，同源性20%≤不同屬的菌種。AFLP的含義是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。有很大功能的DNA指紋技術(shù)。一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。：雙岐索引法，表解法，數(shù)字編碼鑒定法。致病性島：由基因編碼決定的一團(tuán)與致病性相關(guān)的基因組。7. 病原細(xì)菌確定原則：（郭霍Koch原則）從一種疾病病人中能有規(guī)律地發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌能夠分離這種細(xì)菌獲得純培養(yǎng)把這種細(xì)菌的培養(yǎng)物引入易感動物體內(nèi)，可以引起與病人類似的疾病在實驗感染引起的疾病中仍然能夠分離同一種細(xì)菌。8. 桿菌肽用于A（敏感）與非A群鏈球菌的鑒定。O/129抑菌試驗對弧菌有用而對氣單胞菌無用。9. 奧普托欣試驗：肺炎鏈球菌敏感。10. 雜交分：斑點，菌落原位，Southern（DNA）印跡，Northern（RNA，DNA）印跡。11. L型細(xì)菌：細(xì)胞壁缺陷（形態(tài)多樣，染色不定，可過濾，滲透壓敏感，生化減弱等）培養(yǎng)應(yīng)高滲透壓（35%氯化鈉、20%蔗糖）。染色多為G染陰性，形態(tài)不一（巨球形是特征），固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。增殖：以二分裂、出芽、巨形體釋放顆粒方式。一般菌落有：油煎蛋樣（L），顆粒型（G），絲狀菌落（F），鑒定要點：染色易變多形性，生長在增菌液中微渾，顆粒樣沉淀或沿試管壁生長，返祖現(xiàn)象。致病特點：慢性和反復(fù)發(fā)作性感染，致病物質(zhì)是毒素。L型細(xì)菌在體內(nèi)體外都可形成。原生質(zhì)體與原生質(zhì)球都是細(xì)胞壁缺陷的細(xì)菌。12. 細(xì)菌的突變：基因突變（又稱點突變；有堿基對的置換、插入、或缺失、錯碼）、染色體畸變 （易位、倒位、重復(fù)、缺失）。突變：自發(fā)突變、誘發(fā)突變。質(zhì)粒在細(xì)菌的自發(fā)突變中起重要作用。細(xì)菌質(zhì)粒在重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒的分離提純使用酚處理，用乙醇沉淀。、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，專性胞內(nèi)寄生，有嚴(yán)格的宿主特異性。由核酸和蛋白質(zhì)組成。大多數(shù)DNA噬菌體的DNA為線狀雙鏈（有尾噬菌體的核酸）；RNA噬菌體的RNA為線狀單鏈（無尾噬菌體的核酸為環(huán)狀單鏈DNA或線狀單鏈RNA）。對紫外線敏感1015分鐘失去活性。噬菌體分毒性噬菌體、溫和噬菌體（溶原性噬菌體）；毒性噬菌體以復(fù)制方式增殖，過程吸附、穿入、生物合成、成熟與釋放，少脫殼。在液體培養(yǎng)基中使混濁菌液變澄清，在固體培養(yǎng)基上形成噬斑。溫和噬菌體是噬菌體基因組整合于宿主菌染色體中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌體可以根據(jù)不同細(xì)菌的表面受體來裂解目標(biāo)菌是判定某些種類病原體的重要依據(jù)。14. 肽聚糖的結(jié)構(gòu)由聚糖骨架，四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋（G－無交聯(lián)橋）。磷壁酸為G＋特有，分壁和膜兩種。外膜層由脂多糖，脂質(zhì)雙層，脂蛋白組成。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有核蛋白體（蛋白合成地），核質(zhì)（主要遺傳物質(zhì)）質(zhì)粒，胞質(zhì)顆粒，是細(xì)菌蛋白質(zhì)和酶類合成的重要場所。鞭毛是由細(xì)胞質(zhì)伸出的蛋白性絲狀物。性菌毛僅有1～10根，毒力和耐藥質(zhì)粒都能通過它轉(zhuǎn)移，有致病性。15. 免疫器官：骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、小腸集合淋巴結(jié)、闌尾和黏膜免疫系統(tǒng)。免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板。免疫分子：補體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子中樞免疫器官：骨髓、胸腺、鳥類法氏囊。外周免疫器官：淋巴結(jié)、脾和粘膜相關(guān)淋巴組織特異性免疫：體液免疫、細(xì)胞免疫。體液免疫：（B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，CD4+Th輔助，Th2細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子ILILILIL10）；效應(yīng)是抗體（Ab）；病毒中和抗體（不能直接滅活病毒，IgG、IgM、IgA）血凝抑制抗體（HLAb）補體結(jié)合抗體。IgG在體液中含量最多，分子量小是唯一能通過胎盤的抗體。IgM分子量大，是最早產(chǎn)生的抗體，中作早期診斷。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗體。IgE可與肥大細(xì)胞膜上的Fc受體結(jié)合。補體C：存在血清中，不耐熱，可輔助特異性抗體介導(dǎo)的溶菌作用，是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補充條件。由9種成份，11種蛋白組成。補體激活兩個途徑：傳統(tǒng)途徑（一）被AgAb免疫復(fù)合物IC活化，順序CC2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途徑（二）被細(xì)胞的脂多糖激活。補體激活酶促級連反應(yīng)。細(xì)胞免疫（T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，效應(yīng)細(xì)胞：細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）、CD4+Th1細(xì)胞、CD8+毒性T細(xì)胞CTL）。Th1細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）：凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光試驗、膠體金免疫吸附試驗17. 細(xì)菌營養(yǎng)轉(zhuǎn)運的方式有：離子，透性酶，磷酸酶。營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的方式：易化擴(kuò)散、主動運轉(zhuǎn)（由透性酶完成）、基團(tuán)移位（糖類由磷酸酶磷酸化進(jìn)入胞內(nèi)，不能再透出菌體）。18. 細(xì)菌生長繁殖的條件:充足的營養(yǎng)、適宜的溫度、合適的酸堿度、必須的氣體環(huán)境。細(xì)菌生長的溫度極限790℃： 嗜冷菌最適溫為10～20℃，嗜溫菌為20～40℃，嗜熱菌為50～60℃?！?。細(xì)菌生長繁殖分為四期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期19.（腸道桿菌）細(xì)菌的四種生化反應(yīng)：吲哚（I）、甲基紅（M）、VP（V）、枸櫞酸鹽利用（C），合稱為IMViC。大腸桿菌呈++，產(chǎn)氣桿菌呈++。還需做糖發(fā)酵試驗，KIA產(chǎn)酸產(chǎn)氣，MIU＋――，有菌體（O）莢膜（K）鞭毛（H）三抗原。腸桿菌科分型多采用苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗?？梢删謩e接種克氏雙糖鐵（KIA）尿素靛基質(zhì)動力（MIU）來定屬。細(xì)菌代謝所需能量主要以生物氧化作用而來。細(xì)菌新陳代謝的產(chǎn)物：熱原質(zhì)、毒素與酶、色素、抗生素、細(xì)菌素。熱原質(zhì)除去的最好方法蒸餾。內(nèi)毒素（G脂質(zhì)A）、外毒素（G+產(chǎn)生的毒性蛋白質(zhì)產(chǎn)物，具有抗原性強(qiáng)、毒性強(qiáng)、作用特異性強(qiáng)、不耐熱、人工化學(xué)可脫毒性，%甲醛脫毒后形成類毒素進(jìn)行人工免疫）。據(jù)親和性及作用靶點分為:神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、腸毒素。細(xì)菌的內(nèi)毒素一般由：脂質(zhì)A（主要成份），非特異性核心多糖，菌體特異性多糖。一般7～10天后機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。熱原質(zhì)：脂多糖，多由G產(chǎn)生，耐高溫，可引起發(fā)熱反應(yīng)，高壓蒸氣滅菌（121℃20分鐘）使其破壞。20. 細(xì)胞壁的作用：承受胞內(nèi)高滲壓、支持細(xì)胞膜、維持細(xì)菌形態(tài)；是鞭毛運動的支點。細(xì)胞壁的主要成份：肽聚糖（又稱黏肽、胞壁質(zhì)），是原核生物特有的成份，能破壞肽聚分子結(jié)構(gòu)或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌和殺菌作用。G菌細(xì)胞壁的主要成份：肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖（LPS）（類脂A、核心多糖、特異性多糖），菌體脂多糖（LPS）能引起發(fā)熱故稱熱原質(zhì)，又稱為細(xì)菌的內(nèi)毒素。細(xì)胞膜的主要功能：物質(zhì)納泄、生物合成、呼吸作用、形成中介體。細(xì)胞質(zhì)中的異染顆粒主要成份：RNA、多偏磷酸鹽。水中加入2%碳酸鈉能將沸點提到105℃又能防止金屬生銹。22. 紫外線波長265～266nm時殺菌力最強(qiáng)。23. ，另外以石棉板為濾板的金屬濾器稱Seitz濾器（蔡氏濾器）按濾孔大小分K：最大，澄清用，EKS最小，可阻止大病毒通過EK：居中，除去一般細(xì)菌。玻璃濾菌器分G1～G6，G5，G6兩型能阻止細(xì)菌通過。24. 高壓滅菌指示物：嗜熱脂肪芽胞桿菌（ATCC 7053），紫外線殺菌指示物：枯草芽胞桿菌黑色變種（ATCC 9372）。25. 細(xì)菌遺傳物質(zhì)主要在于染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)位因子中。質(zhì)粒：不依賴染色體而復(fù)制，不相容性，轉(zhuǎn)移性，指令性，大多數(shù)質(zhì)粒在自然狀態(tài)下是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA。主要有耐藥質(zhì)粒，Col質(zhì)粒（編碼腸毒素）Vi質(zhì)粒（編碼細(xì)菌與致病性有關(guān)的蛋白）。轉(zhuǎn)位因子為存在于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上的一特異的核苷酸序列可在DNA中移動，主要有三類：插入順序（最小的轉(zhuǎn)位因子），轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座噬菌體。質(zhì)粒載體具有特點：復(fù)制起點、抗菌素抗性基因、多種限制酶的單一切點、較高的拷貝數(shù)：只含一種核酸基因組復(fù)制缺乏完整的酶系統(tǒng)RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（CDNA）。甘油（10％）或10%二甲基亞砜的血清作懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)胞，在干冰溫度（70℃）和液態(tài)氮溫度（196℃）下長期保存其感染性；將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鐘）冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中，解凍做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打開管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。PH59穩(wěn)定；射線和紫外線、X線、r線能滅活病毒。病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類型：原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、傳代細(xì)胞。27. 超凈工作臺應(yīng)采用層流技術(shù)凈化空氣、選擇垂直氣流通風(fēng)方式。潔凈度可達(dá)百級，只保護(hù)樣品。；而堿性染料電離時染料離子帶正電。 ：制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。革蘭染色法：初染（草酸銨結(jié)晶紫）、媒染（碘液）、脫色（95%酒精）、復(fù)染（番紅）?？顾崛旧ǎ?%石炭酸復(fù)紅、5%鹽酸酒精脫色、美蘭復(fù)染。芽胞染色：菌懸液→孔雀綠→水浴1520分鐘→涂片→干燥→固定→水洗脫色→番紅或稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染→水洗→晾干莢膜染色：（負(fù)染色法、墨水法）。負(fù)染色法：制片（蒸餾水+菌）→干燥（晾干）→染色（復(fù)紅）→水洗→干燥（晾干）→涂墨素。背景灰色、菌體紅色、莢膜無色透明鞭毛染色鍍銀法；媒染A液—10%單寧酸10ml+5ml飽和硫酸鉀鋁水溶液+1ml苯胺飽和水溶液+5%氯化鐵水溶液成墨色。銀染B液—5%硝酸銀+濃氨水（）成薄霧狀。制片（蒸餾水+菌）→干燥（晾干）→染色（A液3—5分鐘）→水洗→干燥（晾干）→染色（B液稍加熱分30—60秒）→水洗→干燥（晾干）。菌體深褐色、鞭毛褐色。（VAP）；血凝素（HAs）。病毒的復(fù)制周期：吸附、穿入、脫殼、生物合成及組裝、成熟和釋放：條件致死性突變株，空斑和宿主依賴性。遺傳型變異機(jī)制有突變，基因轉(zhuǎn)移，重組。突變：突變率由復(fù)制的準(zhǔn)確度，DNA發(fā)生損傷的機(jī)會，及對損傷DNA修復(fù)程度來決定。：干擾素（IFN）、NK細(xì)胞 。干擾素（IFN）具有廣譜抗病毒作用，只能抑制病毒，即通過誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)。 ：T細(xì)胞、B細(xì)胞、K細(xì)胞。T細(xì)胞來自骨髓，在胸腺成熟。在人體血液中T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的60—70%，；在胸導(dǎo)管則占95%以上。B細(xì)胞第一個合成產(chǎn)物是u鏈。：嘌呤換嘌呤，嘧啶換嘧啶為轉(zhuǎn)換，嘌呤換嘧啶為顛換。影響基因表達(dá)的因素有：調(diào)控部位，調(diào)節(jié)蛋白，效應(yīng)分子。：受體菌直接攝取供體菌提供的游離DNA片段，整合重組（與染色體重組）使受體菌的性狀發(fā)生變異。一般有鏈，嗜血，芽胞菌有此功能。36. G＋菌等電點pI=2～3，G－菌等電點pI=4～5。RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中占細(xì)菌干重的10%，DNA存在于染色體和質(zhì)粒中。G+菌的感受態(tài)是由感受態(tài)因子（CF）的胞外信號誘導(dǎo)的。37. 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將供體菌的基因轉(zhuǎn)移到愛體菌內(nèi)而致受體菌基因改變，分普遍和局限。38. 接合：受體菌和供體菌直接接觸，供體菌通過性菌毛所帶的F質(zhì)粒或類似遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到受體菌。39. 溶源性轉(zhuǎn)換：是噬菌體的DNA與細(xì)菌染色體重組，使宿主遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。40. 原生質(zhì)融合：兩種經(jīng)過處理失去細(xì)胞壁的原生體混合和可發(fā)生融合后的雙倍體可發(fā)生染色體間的重組。