【正文】 檢驗(yàn)技術(shù)資格考試考點(diǎn)精要——微生物學(xué)檢驗(yàn)（中級(jí)）1. 生物學(xué)按界門(mén)綱目科屬種分類，種是最小單位。病毒分類：目、科、亞科、屬、種。屬名VRirus結(jié)尾的單詞,亞科名VRirinae結(jié)尾的單詞,科名VRiridae結(jié)尾的單詞。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分為：73個(gè)科、11個(gè)亞種、289個(gè)屬。2. 結(jié)核菌可利用甘油為碳源，梭狀芽胞菌可以氨基酸為碳源，流感嗜血桿菌要Ⅴ，Ⅹ因子才能生長(zhǎng)。3. 藥物敏感試驗(yàn)：紙碟法、小杯法、凹孔法、試管法。常用單片紙碟法、試管稀釋法（以抗菌藥物的最高稀釋度仍能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或殺菌管為終點(diǎn)，該管含藥濃度為最低抑菌濃度MIC或最低殺菌濃度MBC），兩值越低則表示越敏感。MIC與抑菌圈呈負(fù)相關(guān)，即抑菌環(huán)直徑越大，MIC越小。各藥敏紙片間距不少于24mm，距平板內(nèi)緣不小于15mm。藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn) ：抑菌圈直徑（毫米）：20以上極敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。 多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏。：酶免疫技術(shù)（EIA）、協(xié)同凝集試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)（IF）、對(duì)流免疫電泳（CIE）、免疫印跡技術(shù)。：核酸雜交、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)。PCR技術(shù)—是選擇DNA或RNA體外擴(kuò)增技術(shù)，用標(biāo)本提取DNA為擴(kuò)增模板，選用一對(duì)特異寡核苷酸為引物，PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，經(jīng)不同溫度變性9394℃（作用1min氫鍵斷裂形成單鏈DNA）、退火4060℃（迅速冷卻3060s引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈）、延伸7075℃（在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四種脫氧核苷酸為原料，從引物5’→3’端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。），擴(kuò)增產(chǎn)物用溴乙啶染色的凝膠電泳。其具有特異、快速、靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、能夠定量。引物是PCR特異性的決定因素，PCR反應(yīng)中TaqDNA聚合酶、引物加量過(guò)多，可引起非靶序列擴(kuò)增。變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變： 1）溶液粘度降低。2）溶液旋光性發(fā)生改變。3）增色效應(yīng)。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過(guò)程稱之為 退火，Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。核酸實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以迅速冷卻至4℃以下方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)?；蛐酒夹g(shù)（DNA芯片、DNA微陣列）—主要過(guò)程：DNA微陣列的制備、樣品的制備、靶分子和探針之間的雜交、雜交信號(hào)的檢測(cè)與分析。具有快速、敏感、高通量檢測(cè)平臺(tái)。核酸雜交（基因探針雜交技術(shù)）是指單鏈RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根據(jù)堿基配對(duì)原則，借氫鍵相連而形成雜交分子的過(guò)程。雜交百分率＞70%（≥69%）為高度同源性，同源性在60%以上是一個(gè)種，同源性在60%70%是同一種內(nèi)不同亞種，同源性在20%60%同一屬內(nèi)不同菌種，同源性20%≤不同屬的菌種。AFLP的含義是擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性。有很大功能的DNA指紋技術(shù)。一種是罕見(jiàn)切割酶，一種是常用切割酶。具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。：雙岐索引法，表解法，數(shù)字編碼鑒定法。致病性島：由基因編碼決定的一團(tuán)與致病性相關(guān)的基因組。7. 病原細(xì)菌確定原則：（郭霍Koch原則）從一種疾病病人中能有規(guī)律地發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌能夠分離這種細(xì)菌獲得純培養(yǎng)把這種細(xì)菌的培養(yǎng)物引入易感動(dòng)物體內(nèi)，可以引起與病人類似的疾病在實(shí)驗(yàn)感染引起的疾病中仍然能夠分離同一種細(xì)菌。8. 桿菌肽用于A（敏感）與非A群鏈球菌的鑒定。O/129抑菌試驗(yàn)對(duì)弧菌有用而對(duì)氣單胞菌無(wú)用。9. 奧普托欣試驗(yàn)：肺炎鏈球菌敏感。10. 雜交分：斑點(diǎn)，菌落原位，Southern（DNA）印跡，Northern（RNA，DNA）印跡。11. L型細(xì)菌：細(xì)胞壁缺陷（形態(tài)多樣，染色不定，可過(guò)濾，滲透壓敏感，生化減弱等）培養(yǎng)應(yīng)高滲透壓（35%氯化鈉、20%蔗糖）。染色多為G染陰性，形態(tài)不一（巨球形是特征），固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。增殖：以二分裂、出芽、巨形體釋放顆粒方式。一般菌落有：油煎蛋樣（L），顆粒型（G），絲狀菌落（F），鑒定要點(diǎn)：染色易變多形性，生長(zhǎng)在增菌液中微渾，顆粒樣沉淀或沿試管壁生長(zhǎng)，返祖現(xiàn)象。致病特點(diǎn)：慢性和反復(fù)發(fā)作性感染，致病物質(zhì)是毒素。L型細(xì)菌在體內(nèi)體外都可形成。原生質(zhì)體與原生質(zhì)球都是細(xì)胞壁缺陷的細(xì)菌。12. 細(xì)菌的突變：基因突變（又稱點(diǎn)突變；有堿基對(duì)的置換、插入、或缺失、錯(cuò)碼）、染色體畸變 （易位、倒位、重復(fù)、缺失）。突變：自發(fā)突變、誘發(fā)突變。質(zhì)粒在細(xì)菌的自發(fā)突變中起重要作用。細(xì)菌質(zhì)粒在重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒的分離提純使用酚處理，用乙醇沉淀。、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，專性胞內(nèi)寄生，有嚴(yán)格的宿主特異性。由核酸和蛋白質(zhì)組成。大多數(shù)DNA噬菌體的DNA為線狀雙鏈（有尾噬菌體的核酸）；RNA噬菌體的RNA為線狀單鏈（無(wú)尾噬菌體的核酸為環(huán)狀單鏈DNA或線狀單鏈RNA）。對(duì)紫外線敏感1015分鐘失去活性。噬菌體分毒性噬菌體、溫和噬菌體（溶原性噬菌體）；毒性噬菌體以復(fù)制方式增殖，過(guò)程吸附、穿入、生物合成、成熟與釋放，少脫殼。在液體培養(yǎng)基中使混濁菌液變澄清，在固體培養(yǎng)基上形成噬斑。溫和噬菌體是噬菌體基因組整合于宿主菌染色體中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌體可以根據(jù)不同細(xì)菌的表面受體來(lái)裂解目標(biāo)菌是判定某些種類病原體的重要依據(jù)。14. 肽聚糖的結(jié)構(gòu)由聚糖骨架，四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋（G－無(wú)交聯(lián)橋）。磷壁酸為G＋特有，分壁和膜兩種。外膜層由脂多糖，脂質(zhì)雙層，脂蛋白組成。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有核蛋白體（蛋白合成地），核質(zhì)（主要遺傳物質(zhì)）質(zhì)粒，胞質(zhì)顆粒，是細(xì)菌蛋白質(zhì)和酶類合成的重要場(chǎng)所。鞭毛是由細(xì)胞質(zhì)伸出的蛋白性絲狀物。性菌毛僅有1～10根，毒力和耐藥質(zhì)粒都能通過(guò)它轉(zhuǎn)移，有致病性。15. 免疫器官：骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、小腸集合淋巴結(jié)、闌尾和黏膜免疫系統(tǒng)。免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板。免疫分子：補(bǔ)體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子中樞免疫器官：骨髓、胸腺、鳥(niǎo)類法氏囊。外周免疫器官：淋巴結(jié)、脾和粘膜相關(guān)淋巴組織特異性免疫：體液免疫、細(xì)胞免疫。體液免疫：（B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，CD4+Th輔助，Th2細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子ILILILIL10）；效應(yīng)是抗體（Ab）；病毒中和抗體（不能直接滅活病毒，IgG、IgM、IgA）血凝抑制抗體（HLAb）補(bǔ)體結(jié)合抗體。IgG在體液中含量最多，分子量小是唯一能通過(guò)胎盤(pán)的抗體。IgM分子量大，是最早產(chǎn)生的抗體，中作早期診斷。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗體。IgE可與肥大細(xì)胞膜上的Fc受體結(jié)合。補(bǔ)體C：存在血清中，不耐熱，可輔助特異性抗體介導(dǎo)的溶菌作用，是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補(bǔ)充條件。由9種成份，11種蛋白組成。補(bǔ)體激活兩個(gè)途徑：傳統(tǒng)途徑（一）被AgAb免疫復(fù)合物IC活化，順序CC2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途徑（二）被細(xì)胞的脂多糖激活。補(bǔ)體激活酶促級(jí)連反應(yīng)。細(xì)胞免疫（T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，效應(yīng)細(xì)胞：細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）、CD4+Th1細(xì)胞、CD8+毒性T細(xì)胞CTL）。Th1細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）：凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、膠體金免疫吸附試驗(yàn)17. 細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式有：離子，透性酶，磷酸酶。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的方式：易化擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)（由透性酶完成）、基團(tuán)移位（糖類由磷酸酶磷酸化進(jìn)入胞內(nèi)，不能再透出菌體）。18. 細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件:充足的營(yíng)養(yǎng)、適宜的溫度、合適的酸堿度、必須的氣體環(huán)境。細(xì)菌生長(zhǎng)的溫度極限790℃： 嗜冷菌最適溫為10～20℃，嗜溫菌為20～40℃，嗜熱菌為50～60℃。—。細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖分為四期：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期19.（腸道桿菌）細(xì)菌的四種生化反應(yīng)：吲哚（I）、甲基紅（M）、VP（V）、枸櫞酸鹽利用（C），合稱為IMViC。大腸桿菌呈++，產(chǎn)氣桿菌呈++。還需做糖發(fā)酵試驗(yàn)，KIA產(chǎn)酸產(chǎn)氣，MIU＋――，有菌體（O）莢膜（K）鞭毛（H）三抗原。腸桿菌科分型多采用苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗(yàn)?？梢删謩e接種克氏雙糖鐵（KIA）尿素靛基質(zhì)動(dòng)力（MIU）來(lái)定屬。細(xì)菌代謝所需能量主要以生物氧化作用而來(lái)。細(xì)菌新陳代謝的產(chǎn)物：熱原質(zhì)、毒素與酶、色素、抗生素、細(xì)菌素。熱原質(zhì)除去的最好方法蒸餾。內(nèi)毒素（G脂質(zhì)A）、外毒素（G+產(chǎn)生的毒性蛋白質(zhì)產(chǎn)物，具有抗原性強(qiáng)、毒性強(qiáng)、作用特異性強(qiáng)、不耐熱、人工化學(xué)可脫毒性，%甲醛脫毒后形成類毒素進(jìn)行人工免疫）。據(jù)親和性及作用靶點(diǎn)分為:神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、腸毒素。細(xì)菌的內(nèi)毒素一般由：脂質(zhì)A（主要成份），非特異性核心多糖，菌體特異性多糖。一般7～10天后機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。熱原質(zhì)：脂多糖，多由G產(chǎn)生，耐高溫，可引起發(fā)熱反應(yīng)，高壓蒸氣滅菌（121℃20分鐘）使其破壞。20. 細(xì)胞壁的作用：承受胞內(nèi)高滲壓、支持細(xì)胞膜、維持細(xì)菌形態(tài)；是鞭毛運(yùn)動(dòng)的支點(diǎn)。細(xì)胞壁的主要成份：肽聚糖（又稱黏肽、胞壁質(zhì)），是原核生物特有的成份，能破壞肽聚分子結(jié)構(gòu)或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌和殺菌作用。G菌細(xì)胞壁的主要成份：肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖（LPS）（類脂A、核心多糖、特異性多糖），菌體脂多糖（LPS）能引起發(fā)熱故稱熱原質(zhì)，又稱為細(xì)菌的內(nèi)毒素。細(xì)胞膜的主要功能：物質(zhì)納泄、生物合成、呼吸作用、形成中介體。細(xì)胞質(zhì)中的異染顆粒主要成份：RNA、多偏磷酸鹽。水中加入2%碳酸鈉能將沸點(diǎn)提到105℃又能防止金屬生銹。22. 紫外線波長(zhǎng)265～266nm時(shí)殺菌力最強(qiáng)。23. ，另外以石棉板為濾板的金屬濾器稱Seitz濾器（蔡氏濾器）按濾孔大小分K：最大，澄清用，EKS最小，可阻止大病毒通過(guò)EK：居中，除去一般細(xì)菌。玻璃濾菌器分G1～G6，G5，G6兩型能阻止細(xì)菌通過(guò)。24. 高壓滅菌指示物：嗜熱脂肪芽胞桿菌（ATCC 7053），紫外線殺菌指示物：枯草芽胞桿菌黑色變種（ATCC 9372）。25. 細(xì)菌遺傳物質(zhì)主要在于染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)位因子中。質(zhì)粒：不依賴染色體而復(fù)制，不相容性，轉(zhuǎn)移性，指令性，大多數(shù)質(zhì)粒在自然狀態(tài)下是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA。主要有耐藥質(zhì)粒，Col質(zhì)粒（編碼腸毒素）Vi質(zhì)粒（編碼細(xì)菌與致病性有關(guān)的蛋白）。轉(zhuǎn)位因子為存在于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上的一特異的核苷酸序列可在DNA中移動(dòng)，主要有三類：插入順序（最小的轉(zhuǎn)位因子），轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座噬菌體。質(zhì)粒載體具有特點(diǎn)：復(fù)制起點(diǎn)、抗菌素抗性基因、多種限制酶的單一切點(diǎn)、較高的拷貝數(shù)：只含一種核酸基因組復(fù)制缺乏完整的酶系統(tǒng)RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（CDNA）。甘油（10％）或10%二甲基亞砜的血清作懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)胞，在干冰溫度（70℃）和液態(tài)氮溫度（196℃）下長(zhǎng)期保存其感染性；將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鐘）冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中，解凍做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打開(kāi)管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。PH59穩(wěn)定；射線和紫外線、X線、r線能滅活病毒。病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類型：原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、傳代細(xì)胞。27. 超凈工作臺(tái)應(yīng)采用層流技術(shù)凈化空氣、選擇垂直氣流通風(fēng)方式。潔凈度可達(dá)百級(jí)，只保護(hù)樣品。；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電。 ：制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。革蘭染色法：初染（草酸銨結(jié)晶紫）、媒染（碘液）、脫色（95%酒精）、復(fù)染（番紅）?？顾崛旧ǎ?%石炭酸復(fù)紅、5%鹽酸酒精脫色、美蘭復(fù)染。芽胞染色：菌懸液→孔雀綠→水浴1520分鐘→涂片→干燥→固定→水洗脫色→番紅或稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染→水洗→晾干莢膜染色：（負(fù)染色法、墨水法）。負(fù)染色法：制片（蒸餾水+菌）→干燥（晾干）→染色（復(fù)紅）→水洗→干燥（晾干）→涂墨素。背景灰色、菌體紅色、莢膜無(wú)色透明鞭毛染色鍍銀法；媒染A液—10%單寧酸10ml+5ml飽和硫酸鉀鋁水溶液+1ml苯胺飽和水溶液+5%氯化鐵水溶液成墨色。銀染B液—5%硝酸銀+濃氨水（）成薄霧狀。制片（蒸餾水+菌）→干燥（晾干）→染色（A液3—5分鐘）→水洗→干燥（晾干）→染色（B液稍加熱分30—60秒）→水洗→干燥（晾干）。菌體深褐色、鞭毛褐色。（VAP）；血凝素（HAs）。病毒的復(fù)制周期：吸附、穿入、脫殼、生物合成及組裝、成熟和釋放：條件致死性突變株，空斑和宿主依賴性。遺傳型變異機(jī)制有突變，基因轉(zhuǎn)移，重組。突變：突變率由復(fù)制的準(zhǔn)確度，DNA發(fā)生損傷的機(jī)會(huì)，及對(duì)損傷DNA修復(fù)程度來(lái)決定。：干擾素（IFN）、NK細(xì)胞 。干擾素（IFN）具有廣譜抗病毒作用，只能抑制病毒，即通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)。 ：T細(xì)胞、B細(xì)胞、K細(xì)胞。T細(xì)胞來(lái)自骨髓，在胸腺成熟。在人體血液中T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的60—70%，；在胸導(dǎo)管則占95%以上。B細(xì)胞第一個(gè)合成產(chǎn)物是u鏈。：嘌呤換嘌呤，嘧啶換嘧啶為轉(zhuǎn)換，嘌呤換嘧啶為顛換。影響基因表達(dá)的因素有：調(diào)控部位，調(diào)節(jié)蛋白，效應(yīng)分子。：受體菌直接攝取供體菌提供的游離DNA片段，整合重組（與染色體重組）使受體菌的性狀發(fā)生變異。一般有鏈，嗜血，芽胞菌有此功能。36. G＋菌等電點(diǎn)pI=2～3，G－菌等電點(diǎn)pI=4～5。RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中占細(xì)菌干重的10%，DNA存在于染色體和質(zhì)粒中。G+菌的感受態(tài)是由感受態(tài)因子（CF）的胞外信號(hào)誘導(dǎo)的。37. 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將供體菌的基因轉(zhuǎn)移到愛(ài)體菌內(nèi)而致受體菌基因改變，分普遍和局限。38. 接合：受體菌和供體菌直接接觸，供體菌通過(guò)性菌毛所帶的F質(zhì)粒或類似遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到受體菌。39. 溶源性轉(zhuǎn)換：是噬菌體的DNA與細(xì)菌染色體重組，使宿主遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。40. 原生質(zhì)融合：兩種經(jīng)過(guò)處理失去細(xì)胞壁的原生體混合和可發(fā)生融合后的雙倍體可發(fā)生染色體間的重組。