【正文】 實驗一 顯微鏡的使用及細菌的革蘭氏染色一、 實驗目的和內(nèi)容（一）實驗目的1. 復習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油鏡的使用方法。2. 初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟（二）實驗內(nèi)容1．學習油浸系物鏡的使用方法。 2．制作細菌染色裝片。 3．進行革蘭氏染色法操作。 4．用油鏡觀察大腸桿菌和蘇云金桿菌染色裝片。二、 實驗原理（一） 油鏡的基本原理 普通光學顯微鏡包括低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡。油鏡是一種高倍放大的物鏡，一般都刻有放大倍數(shù)，如9100等。油鏡頭上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標記，而且油鏡的鏡身較高倍鏡和低倍鏡為長。在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numberal aperture）最大，而工作距離最短（圖31）。 圖11 顯微鏡物鏡參數(shù)圖顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比. 從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。 數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積。影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。 當鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（n＝）與玻璃（n＝）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。當以香柏油（n＝）為介質(zhì)時，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射，不僅增加了視野的照明廢，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。（二）革蘭氏染色革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家Christain Gram創(chuàng)立的，是細菌學中最重要的鑒別染色法，其原理是利用細菌的細胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。三、實驗材料和用具1. 菌種大腸桿菌(Escherichia coli)、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)。 2. 試劑革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸復紅液等）、香柏油、二甲苯。3. 儀器及用具顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。 四、操作步驟(一) 細菌的革蘭氏染色1. 制片 （1）涂菌 用無菌操作方法從平板中沾取菌苔一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1 cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。 （2）干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥（溫度不宜過高）。 （3）固定 將細菌涂片向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色。2. 染色 （1）初染 于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染1 min后，用水洗去剩余染料。 （2）媒染 滴加盧戈氏碘液，1 min后水洗。 （3）脫色 滴加95％乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30 s 至1 min)，立即水洗。 （4）復染 滴加石炭酸復紅液復染1 min，水洗。（5）鏡檢 用濾紙吸干，油鏡鏡檢。 （二）鏡檢1. 觀察前的準備 （1）將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4 cm。坐正。 （2）調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約1mm左右。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察未染色裝片時，光線不宜太強。 2. 低倍鏡觀察染色裝片 首先上升鏡筒，將細菌染色裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方， cm處，適當縮小光圈，然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升（或使鏡臺下降）至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。3. 高倍鏡觀察 眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相撞。再用目鏡觀察，仔細調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部分移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。 4. 油鏡觀察 （1）提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標本的鏡檢部位（鏡頭的正下方）滴一滴香柏油。 （2）從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。 （3）將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，直至視野中有物像出現(xiàn)時，再用細調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快未找到物像．必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復操作直至物像看清為止。仔細觀察并繪圖。 （4）再次觀察，提起鏡筒，換上另一塊細菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察。繪圖。重復觀察時可比第一次少加香柏油。 5. 鏡撿完畢后的工作 （1）移開物鏡鏡頭。 （2）取出裝片。 （3）清潔油鏡油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯，擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。 （4）擦凈顯微鏡，將各部分還原；將接物鏡呈“八“字形降下，不可使其正對聚光器，同時降下聚光器，轉(zhuǎn)動反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，陰涼干燥處存放。 (三) 結(jié)果 革蘭氏陽性菌染成藍紫色, 革蘭氏陰性菌染成淡紅色。 五、注意事項1．細菌涂片務求均勻．切忌過厚。2．在染色過程中，不可使染液干涸。 3．脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。 4．老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。 5．使用油鏡必須先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察的程序操作； 6．下降鏡頭時，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯誤操作．以免壓碎玻片而損壞鏡頭。 7．使用二甲苯擦鏡頭時，二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。 8．注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。 六、實驗報告1. 分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。 2. 記錄革蘭氏染色法步驟，并進行結(jié)果分析。 七、問題和思考 1．涂片后為什么要進行固定，固定時應注意什么?