【正文】 DNA甲基化與腫瘤分子標(biāo)志 一、前言 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)病和高死亡率性疾病，大量研究和防治資料證實(shí)，早期診斷和早期治療是防治腫瘤與降低死亡率的最有效辦法。因此，長(zhǎng)期以來尋找能早期診斷的腫瘤標(biāo)志物（ Tumor marker， TM)成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。 以肺癌為例，在我國(guó)肺癌是第一大癌癥，超過癌癥死因的 20%，且發(fā)病率與死亡率增長(zhǎng)迅速。肺癌的預(yù)后與診斷是的臨床分期密切相關(guān)： 0期肺癌患者術(shù)后的 5年生存率可達(dá) 90%以上， Ⅰa 可達(dá) 60%，而 Ⅱ ～ Ⅳ 期病人總的 5年生存率則從 40%下降到 5%以下。 二、腫瘤標(biāo)志與腫瘤分子標(biāo)志 腫瘤標(biāo)志物（ Tumor Marker， TM）是指在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而異常產(chǎn)生和（或）升高的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因產(chǎn)物等。 （ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)腫瘤標(biāo)志物專家委員會(huì)） 腫瘤分子標(biāo)志 20世紀(jì)九十年代初，有文章提出“ Tumor BioMarker”一詞，即 “ 腫瘤生物標(biāo)志 ” ，以后隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，國(guó)內(nèi)外眾多科學(xué)家稱遺傳學(xué)（ geic）和表遺傳學(xué)（ Epigeic）水平，即基因及基因以外的分子水平（核酸分子）的腫瘤標(biāo)志為 “ 腫瘤分子標(biāo)志 ” 。雖然對(duì)于這些名詞沒有公開的確認(rèn)，但其已越來越廣泛地被人們接受和應(yīng)用。 三、 DNA甲基化 （一） DNA甲基化與 CpG島 （二） DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控 （三） DNA甲基化與腫瘤 （四） DNA甲基化 — 腫瘤分子標(biāo)志物 （五） DNA甲基化檢測(cè)方法 （一） DNA甲基化與 CpG島 DNA甲基化 在人類和大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，基因組序列中的 CpG二核苷酸的胞嘧啶堿基（ C） 5位上存在甲基化。 DNA甲基化是由 S腺苷蛋氨酸作為甲基供體，在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下完成的。甲基化是真核生物 DNA的一種最常見的修飾方式，也是一種重要的表遺傳（ Epigeic，基因型不變，而表現(xiàn)型改變）機(jī)制。 CpG島 甲基化位點(diǎn)通常發(fā)生在 CpG二核苷酸的胞嘧啶堿基上，在哺乳動(dòng)物基因組中大約 70% 的 CpG二核苷酸位點(diǎn)是甲基化的，但 CpG二核苷酸在整個(gè)基因組中的分布是不均勻的，基因組的大部分區(qū)域 CpG序列出現(xiàn)頻率較低，但在某些特定區(qū)域，如結(jié)構(gòu)基因的 5′ 端， CpG二核苷酸以正常的頻率成串排列，這種區(qū)域被稱為 CpG島。在人類基因組中大約有 2900045000個(gè) CpG島，占總 DNA的1%左右， 60%的基因（包括全部的看家基因和 40%的組織特異性表達(dá)基因）都含有 CpG島，每一個(gè) CpG島長(zhǎng)度約為 12Kb， 位于基因的 5ˊ 端，覆蓋基因啟動(dòng)子及第一外顯子。 CpG Methylation ? CpG Island ? Promoter Housekeeping gene ? ? 12kb ? : Methylated CpG : Unmethylated CpG 胞嘧啶堿基的轉(zhuǎn)化 DNA甲基化的特點(diǎn) ? 異常甲基化 (Aberrant methylation) 過甲基化 (Hypermethylation) 低甲基化 (Hypomethylation) ? 甲基化方式 從頭甲基化 (de novo methylation) 維持甲基化 (maintenance methylation) （二） DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控 DNA甲基化與印跡（ imprinting） 基因 。 DNA甲基化與胚胎的正常發(fā)育 。 DNA甲基化與雌性個(gè)體 X染色體失活 。 DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄失活 . DNA甲基化 抑制轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 （三） DNA甲基化與腫瘤 DNA甲基化、基因突變與腫瘤 。 甲基化不足與腫瘤 。 抑癌基因過甲基化與腫瘤 . TSG（ tumour suppressor gene)的過甲基化被 認(rèn) 為是 導(dǎo) 致其 表 達(dá)失 活 的第 三 條途 徑 。Kundon’s假說認(rèn)為一個(gè)抑癌基因完全失活需要兩次打擊 ， 這個(gè)假說幾乎在所有的人類腫瘤中被證明基本正確 。 長(zhǎng)期以來 ， 認(rèn)為抑癌基因失活有兩條途徑：基因突變和染色體物質(zhì)丟失 （ 雜合性丟失 LOH或等位基因丟失 ） ， 近年來的研究顯示 ，甲基化是 TSG失活的第三條機(jī)制 ， 而且在某些情況下是抑癌基因失活的唯一機(jī)制 。 目前的研究集中在以下 3類基因 : 抑癌基因： Rb、 VHL、 p1 p1 p1 p5 p7BRCA APC、 FHIT、 RAR223。 RASSF1A； DNA損傷修復(fù)基因： MGMT和 hMLH1； 腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因： Ecadherin、 DAPK、 TIMP3 代謝酶基因： GSTP1 這些基因涉及細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào) 控、凋亡、 DNA損傷修復(fù)及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過 程。幾乎所有的人類腫瘤中都存在腫瘤相關(guān)基因 的異常甲基化。 DNA過甲基化與腫瘤 (四） DNA過甲基化 — 腫瘤分子標(biāo)志物 如前所述， 基因啟動(dòng)子過甲基化的本質(zhì)是一種 DNA分子異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，特別是腫瘤抑制基因的過甲基化是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活的一個(gè)重要原因。這種甲基化比其它各種類型的 DNA分子異常（如基因點(diǎn)突變、基因缺失、微衛(wèi)星序列改變、基因異常擴(kuò)增及染色體異常等）都更加廣泛地存在于幾乎所有種類的腫瘤中。許多研究顯示啟動(dòng)子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過程中是 一個(gè)頻發(fā)的早期事件 ，因此腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是一種有前景的腫瘤分子生物標(biāo)志物 . CpG島異常甲基化 是腫瘤的發(fā)生過程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件（ early event) ⑴ 許多基礎(chǔ)研究證實(shí)腫瘤相關(guān) 基因啟動(dòng)子的過甲基化發(fā)生細(xì)胞癌變的 早期 ,在腫瘤的發(fā)生過程中是 〝 一個(gè)頻發(fā)的早期事件 〞 . ⑵ 這種甲基化 廣泛 地存在于幾乎所有種類的腫瘤中。 CpG島異常甲基化 作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn) （ 1）樣品多樣化且容易獲得 癌變細(xì)胞可以釋放 DNA到外周血中，腫瘤患者外周血中游離 DNA（ free DNA)的含量比正常人中高 4倍 .研究發(fā)現(xiàn)外周血血漿 /血清、腫瘤累積器官相關(guān)的體液（如唾液、痰、尿液及支氣管灌洗液等）中同樣可以檢測(cè)到腫瘤組織中存在的腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子異常甲基化。這些生物樣品比較容易獲得，因此檢測(cè)其中某些腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，可以為腫瘤的早期診斷提供非常有價(jià)值的信息。 （ 2） 較其它類型的腫瘤分子標(biāo)記物更易檢測(cè) 如檢測(cè)點(diǎn)突變，即便是同一個(gè)基因，在不同腫瘤中甚至同類腫瘤的不同個(gè)體中，發(fā)生突變的位點(diǎn)也常常不同，以現(xiàn)有技術(shù)要全部檢測(cè)非常困難。然而某一基因在不同類型腫瘤中，其啟動(dòng)子異常甲基化的區(qū)域是相同的，檢測(cè)比較方便；另外與等位基因缺失這樣的標(biāo)志物相比，異常甲基化是一個(gè)陽性信號(hào)，很容易與正常組織中的陰性背景區(qū)分。 （ 3）特異性與靈敏度 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，涉及到許多基因的異常，如癌基因的激活以及抑癌基因的失活等，是多種遺傳變異的積累所致。對(duì)于絕大多數(shù)腫瘤，這些基因都是腫瘤相關(guān)性的，而非腫瘤特異性的。雖然不同種類的腫瘤中可能都存在某一基因的異常甲基化，但是不同類型的腫瘤中不同基因的甲基化發(fā)生頻率是不同的，存在著明顯的基因 — 腫瘤類型相關(guān)性，每種腫瘤都有一個(gè)獨(dú)特的基因甲基化譜。因此在以基因啟動(dòng)子的異常甲基化作為腫瘤發(fā)生的生物標(biāo)志物時(shí)，應(yīng)首先了解一些關(guān)鍵基因在各種腫瘤中的甲基化情況，然后在多種候選基因中優(yōu)化選擇 3～ 4種相關(guān)程度高的基因，檢測(cè)其甲基化狀態(tài)。這樣可以做到在檢測(cè)較少指標(biāo)的同時(shí)保持標(biāo)志物的敏感性和特異性。 靈敏度問題 指標(biāo)本身的敏感性 檢測(cè)方法的敏感性 不同類型腫瘤中相關(guān)基因的甲基化情況 腫瘤類型