【文章內(nèi)容簡介】 ( Methylation) ( Unmethylation) PCR primerM primerU CG CG UG UG Gel electrophoresis 結(jié)合 HSO3限制性分析法（ COBRA) 該法首先用 HSO3處理基因組 DNA， 然后 PCR擴增待檢測含 CpG位點的序列，由于 HSO3處理引起的序列改變可導致新的甲基化限制性酶切位點的產(chǎn)生或可引起原來已存在的酶切位點如 BstUⅠ 的丟失，故原始DNA甲基化水平可通過消化的與未消化的 PCR產(chǎn)物的相對數(shù)量來表示。 優(yōu)點 :快速的、靈敏的半定量方法 。 缺點 :定量信息依賴于限制性內(nèi)切酶的完全消化，且甲 基化分析也受 DNA中限制性酶切位點的限制 ,能滿 足上述要求的位點非常有限。 甲基化敏感的單核苷酸引物法（ MsSNuPE) 基因組 DNA經(jīng)處理后 ,未甲基化的 C→U ， U在隨后的 PCR中象 T一樣被復制；而 5mC則保持不變，在 PCR中象 C一樣被復制。 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，同合適的 SNuPE引物、Taq聚合酶和 32PdCTP以及 32PdTTP一起孵育后，在進行變性PAGE和放射自顯影分析，這樣就很容易地對某個特定的 CpG位點中甲基化與非甲基化的 C的原始狀態(tài)比例進行定量分析。 優(yōu)點 :靈敏、半定量分析； 缺點 :操作十分繁瑣，既要凝膠電泳分離，又要進行放射性 標記。 PCR— RFLP法 用 HSO3處理基因組 DNA， 處理后的 DNA的 PCR產(chǎn)物中限制性酶切位點改變，從而可用于那些不需要對序列中特定區(qū)域內(nèi)每個 CpG島甲基化進行快速分析。優(yōu)點是操作簡便；缺點是僅能分析 25%的甲基化位點。 HSO3PCR— SSCP： 操作繁瑣，分辨率不高。 熒光定量 PCR(Methylight)： 靈敏、準確；但需專門 儀器，檢測費用昂貴。 1 變性高效液相色譜法（ DHPLC)： 僅能檢測擴增區(qū)域 內(nèi)的甲基化總量，不能對甲基化的 CpG位點精確定位。 第二部分： 巢式甲基化特異性 PCR檢 測 DNA甲基化 一、目的 目前用于檢測 DNA甲基化的最常用方法是甲基化特異性 PCR法（ MSP）， 但在檢測血清等樣品時，由于DNA含量低，方法靈敏度有待提高。本研究將巢式PCR用于甲基化分析，建立巢式甲基化特異性聚合酶鏈式反應（ nMSP） 法，探討了最佳 PCR擴增條件，并用該法分析了新鮮癌組織、石臘包埋組織及腫瘤患者血清中 p16基因啟動子的甲基化狀態(tài)。 二、方法 DNA提取 ： 新鮮癌組織、石蠟包埋組織及血清樣品 DNA提取。 基因組 DNA的亞硫酸氫鹽修飾： ⑴ 堿變性； ⑵ 硫化與脫氨； ⑶ 純化與脫硫； ⑷ 沉淀回收 DNA 。 巢式 PCR擴增 （ 1）引物設計：引物設計是以亞硫酸氫鹽修飾后的基因組 DNA為模板，外側(cè)引物序列不包含 CpG位點，故可同時擴增甲基化及非甲基化目的片段；內(nèi)側(cè)引物包含 CpG位點，分別為甲基化及非甲基化特異性的。 （ 2）第一次擴增：同時擴增甲基化及非甲基化目的片段，產(chǎn)物長 280bp。 （ 3）將第一輪 PCR產(chǎn)物適當稀釋（ 50倍），取 10μl進行第二輪 PCR反應 。 （ 4）以正常人外周血淋巴細胞（ PBL） DNA作陰性對照，以水作空白對照。人移行細胞膀胱癌細胞株（ T24） 的 p16基因啟動區(qū)是高度甲基化的，故以 T24細胞DNA作為陽性對照。 （ 5）同時用 MSP法檢測腫瘤患者血清樣品中 p16基因的甲基化。 （ 6）凝膠電泳分析。 三、結(jié)果 nMSP法檢測結(jié)果 T T′ S N P H2O MK M U M U M U M U M U M U nMSP法與 MSP法的檢測結(jié)果比較 分別用 MSP和 nMSP法檢測了 34例非小細胞肺癌患者的血清中 p16基因的甲基化狀態(tài)， MSP和 nMSP法甲基化檢出率分別為 53％ (18/34)和 74％ (25/34) (P,χ 2test)。 7例 MSP法檢測為非甲基化的血清標本 7例 MSP法檢測為非甲基化的血清標本經(jīng) nMSP法擴增出了甲基化的 DNA片段 . C1 P C2 H2O MK Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ 陽性樣品測序結(jié)果 Ⅰ.3ˊ GCAGGAGGTCTCAGCGGGCGGTAGGGGACGAGGGCGACGTCTGGGAGATGGGTGGACCTAGC5ˊ Ⅱ.3ˊ GCAGGAGGTTTTAGCGGGCGGTAGGGGATGAGGGCGATGTTTGGGAGATGGGTGGATTTAGC5ˊ Ⅲ .5ˊ CGTCCTCCAAAATCGCCCGCCATCCCCTACTCCCGCTACAAACCCTCTACCCACCTAAATCG3ˊ 四、結(jié)論 巢式甲基化特異性 PCR（ nMSP)是一種靈敏度高、特異性強的甲基化檢測方法，可廣泛應用于不同類型標本基因啟動子甲基化分析。 利用巢式甲基化特異性 PCR（ nMSP） 法可用于檢測外周血血清中腫瘤相關基因的甲基化狀態(tài) 。 nMSP法比 MSP法具有更高的靈敏度。 第三部分：建立一種 DNA甲基 化的定量分析方法 一、目的 建立一種基于錯配雜交和化學發(fā)光檢測的DNA甲基化定量分析方法。 二、原理 Denaturation of Genomic DNA。 Bisulfite Modification。 PCR Amplification。 Hybridization。 Detection. Genomic DNA(M and U) Denature and modification CG UG PCR amplification (Biotinylated primer without CpGs) B CG B TG GC AC Hybridization SPA B CG SPA B TG GC AC