原核基因表達(dá)及其調(diào)控(已修改)
2025-05-28 13:26 本頁面
【正文】 第二章 原核微生物的基因表達(dá)與操作 原核微生物的基因表達(dá)及其調(diào)控 原核微生物的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （ 1）轉(zhuǎn)錄因素； （ 2）翻譯因素； （ 3）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性； （ 4）胞外分泌的特性 一、原核生物的基因表達(dá) 第一節(jié) 原核生物的基因表達(dá)與調(diào)控因素 （一）、轉(zhuǎn)錄對基因表達(dá)的影響 要注意的關(guān)鍵名詞術(shù)語 : 1) 編碼鏈（有義鏈， the coding strand） 。 6) 轉(zhuǎn)錄單位（ A transcription unit） 。 2) 反義鏈（模板鏈， the template strand） 。 7) 上游（ Upstream） 。 3) RNA聚合酶（ RNA polymerase） 。 8) 下游（ Downstream） 。 4) 啟動子（ A promoter） 。 9) 轉(zhuǎn)錄起始位點 (Startsite)。 5) 終止子（ A terminator） 。 10) 初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 A primary transcript 新生 RNA序列與模板鏈 互補(bǔ)；與編碼鏈相同。 原核生物 RNA聚合酶 大腸桿菌提取的 RNA聚合酶：由 五個亞基組成 ，分子量為 500 kDa。 核心酶（ ?2ββ’）： 轉(zhuǎn)錄功能單位 全酶（ ?2 ??’?） （ core enzyme） （ holoenzyme） σ因子 ：參與識別特異的啟動子 原核生物 RNA聚合酶能被 利福平（ rifampicin）所抑制 。 利福平與 β 亞基相結(jié)合，從而抑制酶的活性。 RNA聚合酶可形成 1個中間管道 (二 )、原核生物基因的翻譯 起始因子 Initiation factors (IFs) 可穩(wěn)定自由狀態(tài)的 30S 亞基；以及結(jié)合起始 tRNA到 30SmRNA復(fù)合物上 二、 可調(diào)控啟動子驅(qū)動的基因表達(dá) 微生物表達(dá)系統(tǒng)： （ 1）功能基因； （ 2） 載體； （ 3） 受體菌： 大腸桿菌 枯草芽胞桿菌 其它細(xì)菌受體菌 酵母菌 昆蟲細(xì)胞 哺乳動物細(xì)胞等 E. coli用作受體菌的優(yōu)勢： （ 1）對其遺傳學(xué)背景、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生 理學(xué)方面的了解較為深入； （ 2）很多目的基因能在 E. coli中迅速而有效地表達(dá)； （ 3）其培養(yǎng)條件易于掌控，培養(yǎng)費(fèi)用相對較低。 。 啟動子： DNA分子中與 RNA pol I發(fā)生特定結(jié)合的序列，啟動轉(zhuǎn)錄過程。 啟動子有 強(qiáng) /弱之分。 E. coli的啟動子： （ 1） 10 region： TATA box（ Pribnow box） T77A76T60A61A56T82 （ 2） 35 region： 為 RNA pol I初始結(jié)合區(qū)。 T69T79G61A56C54A54 非調(diào)控啟動子：對細(xì)胞產(chǎn)生傷害 (1) 持續(xù)性地高水平表達(dá)某一目的基因會過分消耗宿 主細(xì)胞的營養(yǎng)和能源，最終造成致死效應(yīng) 。 (2) 由于使宿主細(xì)胞處于生長的逆境，容易發(fā)生載體 質(zhì)粒的丟失； (3) 非調(diào)控性地表達(dá)外源蛋白，容易受到蛋白酶的水 解作用，從而使最終的蛋白量并不高； (4) 形成不溶性的包含體蛋白。 （一）可調(diào)控啟動子 (Regulatable Promoters)： 大腸桿菌中已開發(fā) 5種可調(diào)控啟動子 (1) Plac 啟動子：即 E. coli lac啟動子 。 (2) Ptrp 啟動子：即 E. coli trp啟動子； (3) Ptac 啟動子：由 lac和 trp組成的雜合啟動子。 即 E. coli lac (10 區(qū) ) ＋ E. coli trp (35 區(qū) ) (4) PL 啟動子：基于噬菌體 ?的啟動子； (5) Pt7 啟動子：噬菌體 T7 的基因 10啟動子 可調(diào)控啟動子的特征： （ 1）通過與阻遏蛋白的相互作用，提供一個 開關(guān)系統(tǒng)，使啟動子能在特定條件下發(fā) 生關(guān)閉或者開放； （ 2）容易被大腸桿菌的 RNA聚合酶全酶所識 別。 四種簡單類型控制通路 誘導(dǎo)作用是指存在誘導(dǎo)物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一個激活蛋白而解除阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄起始過程的阻遏； 阻遏作用是指一個輔阻遏物激活一種阻遏蛋白，或者使一種激活蛋白失活而對轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生阻遏作用。 lac 啟動子 ： （ 1） lac啟動子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子，包括啟動子、活化蛋白（ catabolite activator protein, CAP）結(jié)合位點、操縱基因和 lacZ組成。 （ 2） lac啟動子受到阻遏蛋白（ repressor）的負(fù)調(diào)控，而受到CAP和 cAMP的正調(diào)控。其中 CAP的正調(diào)控是通過增加啟動子與 RNA聚合酶的親和性而起作用。 (3) lac 啟動子由于與阻遏蛋白相結(jié)合而處于關(guān)閉狀態(tài)，但當(dāng)加入乳糖或者半乳糖苷結(jié)構(gòu)類似物，如異丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）、硫甲基半乳糖苷（ TMG）和鄰硝基苯基半乳糖苷（ ONTG）后可發(fā)生脫阻遏作用。 乳糖操縱子基因產(chǎn)物 : 1) lacI: 阻遏蛋白 。 2) lacZ： ?半乳糖苷酶； 3) lacY： 透性酶 。 4) lacA：硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；? cAMP參與乳糖操縱子的調(diào)控： （ 1） cAMP通過與 cAMP受體蛋白（ CRP）結(jié)合，引起 CRP構(gòu) 象變化，形成一種有活性的 cAMPCRP復(fù)合物； （ 2）乳糖操縱子啟動基因（ O）有 2個位點：一個與 RNA聚合 酶結(jié)合；另一個與 cAMPCRP結(jié)合，而且只有后者結(jié)合 后才能與啟動基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄過程； （ 3） cAMPCRP復(fù)合物不僅可以與一個啟動基因結(jié)合，而且 還可以與幾個操縱子上的啟動基因結(jié)合，從而影響到許 多操縱子。 Glucose reduces CRP activiy CRP復(fù)合物形
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