【正文】 RP復(fù)合物形成促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合 當(dāng) CAP與 cAMP協(xié)同作用時(shí)，其對(duì)啟動(dòng)子的親和性發(fā)生增強(qiáng)，而此時(shí)如果葡萄糖的量達(dá)到最低時(shí)，其親和性最高。 trp promoter色氨酸啟動(dòng)子 由色氨酸阻遏蛋白進(jìn)行調(diào)控：正調(diào)控作用。 trp 啟動(dòng)子的脫阻遏可通過： （ 1）移除色氨酸； （ 2）加入色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid） . 3’?吲哚丙烯酸 色氨酸操縱子（ trp operon） 由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的 5種酶組成。當(dāng)色氨酸缺乏時(shí)，該阻遏蛋白的前體不能與操縱基因結(jié)合，也就不能發(fā)揮阻遏作用； （ 2）當(dāng)細(xì)胞中的色氨酸濃度較高時(shí)，在衰減子的作用下，操縱子 DNA形成類似終止子的 莖環(huán)結(jié)構(gòu) ，從而只能翻譯出 14肽，稱為前導(dǎo)肽。 Ptac 啟動(dòng)子 ： 是來自于 lac和 trp的一組雜合啟動(dòng)子，但是比 lac和 trp都強(qiáng)得多，是一組強(qiáng)啟動(dòng)子。 PL 啟動(dòng)子 ： 阻遏蛋白 : cI，來源于噬菌體 ?. cI857 : 為 cI溫度敏感突變體 . (1) 將攜帶敏感的 cI857 的細(xì)菌細(xì)胞首先在 28 to 30?C條件下 培養(yǎng)，此時(shí) cI857 阻遏 PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄； (2) 當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)至特定濃度時(shí)（一般是到達(dá)平衡 期），將培養(yǎng)溫度升高至 42?C, 此時(shí) cI857 不再發(fā)生阻 遏作用， PL啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。 ?噬菌體左向操縱子結(jié)構(gòu)示意圖 PL 啟動(dòng)子 (二 )、常用原核表達(dá)載體 大量產(chǎn)物的獲得： （ 1）強(qiáng)的、可調(diào)控的啟動(dòng)子； （ 2） 翻譯效率； （ 3）新生肽穩(wěn)定性等。 優(yōu)良表達(dá)載體的性能 （ 1）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子； （ 2）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）的強(qiáng)弱； （ 3）質(zhì)粒載體及其質(zhì)粒的拷貝數(shù)；是否整合到 染色體 DNA之上； （ 4）合成的外源蛋白在細(xì)胞中的定位； （ 5）宿主的翻譯效率； （ 6）克隆載體所表達(dá)的外源蛋白的穩(wěn)定性。其最大的特點(diǎn)是帶有編碼 lacZ（ ?半乳糖苷酶 ）的編碼序列。 所有含 lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到 IPTG的誘導(dǎo)。 pOP203系列表達(dá)載體： A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter pOP2031,2, pOP2031 pOP2032 pOP2032 pOP2032 pOP20329 表達(dá)載體 pOP203質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖 含 trp 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： （ 1） 產(chǎn)生的表達(dá)蛋白的量高于 lac啟動(dòng)子； （ 2） 所有含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到 3?吲哚丙烯 酸（ IAA）的誘導(dǎo)。 質(zhì)粒載體 pDR720結(jié)構(gòu)示意圖 含 tac 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 高表達(dá)效率啟動(dòng)子； 受 IPTG的誘導(dǎo)。如： pKK2233。 pTrcHisA, B, C。 含 PL 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子，所以被廣泛用于各種載體的 構(gòu)建； 如： pPL?。 質(zhì)粒載體 pPL?結(jié)構(gòu)示意圖 （三）提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量 某些表達(dá)載體被構(gòu)建用于增加蛋白質(zhì)的表達(dá)量，例如，pPLc2833 : （ 1）強(qiáng)啟動(dòng)子； （ 2）選擇性標(biāo)記； （ 3）多克隆位點(diǎn)（ MCS） 其衍生質(zhì)粒 pCP3的構(gòu)建：將 pPLc2833的復(fù)制起始位點(diǎn)替換為另一個(gè)質(zhì)粒 pKN402。 電泳后回收片段 c 電泳后回收片段 1和 3 連接 由于 pKN402和 pCP3的復(fù)制子在 42?C時(shí)仍然具有很強(qiáng)的起始復(fù)制能力，因此當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到 42?C時(shí)，細(xì)胞中的pKN402和 pCP3的拷貝數(shù)要比 pPLc2833高 5～ 10倍。 一種解決的途徑：使用 “ 雙質(zhì)粒系統(tǒng) ” ：用 trp啟動(dòng)子帶動(dòng)編碼 cI阻遏蛋白的基因，然后將它們置于一個(gè)弱啟動(dòng)子的載體上；將要表達(dá)的外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子 PL之下，使其受 PL啟動(dòng)子的控制。 A 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 B 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 cI蛋白合成 （脫阻遏） 無克隆基因蛋白 合成（阻遏） 克隆基 因蛋白 合成 （脫阻遏 ） cI蛋白不合成 （阻遏） （五）在其它微生物中的表達(dá) 除了 E. coli以外，有些微生物也可以用作表達(dá)外源蛋白的宿主菌（受體菌）。 chloramphenicol acetyltransferase （氯霉素轉(zhuǎn)乙?；福? ?galactosidase （ ?半乳糖苷酶 ） 其有效表達(dá)可在產(chǎn)堿桿菌（ Alcaligens sp.） , E. coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stutzeri, 熒光假單胞菌 （ Pseudomonas fluorescens） , 和粘質(zhì)沙雷氏菌（ Serratia marcescens）觀察到 . 在革蘭氏陰性菌中通用的表達(dá)載體： pAV10 (1) 將轉(zhuǎn)座子 Tn5的一個(gè)末端倒置重復(fù)序列的 70bp插入到一個(gè)廣宿 主的、低拷貝數(shù)質(zhì)粒 pRK290的 MCS中所得； (2) 其 Tn5 DNA中含有 2個(gè)獨(dú)立的、但序列有部分重疊的啟動(dòng)子， 每個(gè)啟動(dòng)子分別調(diào)控一個(gè) Tn5基因的轉(zhuǎn)錄，因此該載體在許多 革蘭氏陰性菌中都起作用。 廣 宿 主 載 體 （六）非融合蛋白的表達(dá) 指所表達(dá)的外源蛋白的 N末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻譯起始位點(diǎn) ATG必須要位于其基因的 5’端。 RBS－ ATG最適距離的篩選： （ 1）在 ATG上游約 100 bp處尋找 1個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切； （ 2）再用核酸外切酶 III（ ExoIII）從該酶切位點(diǎn)開始，部分消化以上酶切片斷，得到不同長(zhǎng)度的消化片斷； （ 3）將各消化片斷與含有啟動(dòng)子序列和 RBS序列的載體連接，構(gòu)建成系列可表達(dá)的重組基因，導(dǎo)入受體菌進(jìn)行表達(dá)量分析，從中篩選到最適的 RBSATG距離。 表達(dá)非融合蛋白的優(yōu)勢(shì)： 單基因產(chǎn)物，不受其它蛋白質(zhì)成分的干擾，有利于其展現(xiàn)完整功能和保