【正文】 2/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 歸納以上， 可誘導(dǎo)的操縱子是一些編碼糖和氨基酸分解代謝的酶和蛋白質(zhì)的基因，這些物質(zhì)平時含量很少，因為細菌總是利用最容易利用的能源物質(zhì)，如葡萄糖的分解來提供能量，所以這些操縱子通常是關(guān)閉的。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 可阻遏的基因情況正好相反，它們是一些 合成各種細胞代謝過程中所必需的重要物質(zhì)（如氨基酸、核苷酸等）的基因，由于這些物質(zhì)在生命活動過程中的重要地位，其基因在正常情況下總是開著的。 ? 可見，細菌細胞的代謝活動十分精密而經(jīng)濟有效。 這種情況下細菌無需開動一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。 ? 理想的 lac操縱子正調(diào)控因子應(yīng)能感知葡萄糖的缺乏，并通過激活 lac啟動子做出應(yīng)答，使聚合酶與啟動子結(jié)合而轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因。 ? 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 葡萄糖的存在可抑制細菌細胞中的腺苷酸環(huán)化酶，減少了 環(huán)腺苷酸（ cAMP） 的合成， 與它結(jié)合的受體蛋白質(zhì) CAP因找不到配體而不能形成復(fù)合物。 所以 葡萄糖存在時，不易形成復(fù)合物 cAMPCAP，受其調(diào)控的基因就不表達。 能對葡萄糖濃度變化做出應(yīng)答的物質(zhì)是環(huán)腺苷酸。 ? C Zubay研究發(fā)現(xiàn)了一類 lac突變體 ，其 CAP和CAMP不能促進 lac操縱子轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? (A)無 CAP時， 聚合酶與含 lac啟動子 DNA片段隨機松散結(jié)合，在同時加入利福平及核苷酸后這種結(jié)合受利福平抑制，故無轉(zhuǎn)錄發(fā)生； (B)有 CAP和 CAMP 時，聚合酶與 lac啟動子結(jié)合形成開放啟動子復(fù)合體，在同時加入利福平及核苷酸后這種結(jié)合不受利福平抑制，因為核苷酸先于利福平與聚合酶結(jié)合，使開放啟動子復(fù)合體能夠啟動核苷酸聚合，一旦第一個磷酸二酯鍵形成，聚合酶在重新起始轉(zhuǎn)錄前一直具有利福平抗性，在這些條件下能夠轉(zhuǎn)錄，表明 CAP和 CAMP促進開放啟動子復(fù)合體形成。 ? 在乳糖操縱子的主啟動子上游 22bp處有另一個可選擇性啟動子。 ? P2能限定聚合酶在它的序列上的結(jié)合數(shù)量，從而使更多的游離聚合酶與啟動子 P1結(jié)合，提高lac操縱子的轉(zhuǎn)錄，這是 CAPcAMP的另一個作用機制。這種效應(yīng)有較多實驗證據(jù)支持： ①有 cAMP時，通過超速離心可使 CAP和 RNA聚合酶共沉淀，表明兩者之間具有親和性； ②當(dāng) CAP和聚合酶與各自的 DNA靶位結(jié)合后，彼此還能發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，表明兩者在空間上彼此十分靠近； 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ③ DNase足跡實驗顯示 CAPcAMP的足跡與聚合酶的足跡相鄰，因此兩者的 DNA結(jié)合位點距離很近，足以使它們在各自的 DNA位點結(jié)合后能發(fā)生互作；④一些 CAP的突變能降低轉(zhuǎn)錄，但不影響與 DNA的結(jié)合 (或彎曲 )，其中一些突變改變了與聚合酶相互作用的 CAP區(qū)域的氨基酸； ⑤推測與 CAP的激活區(qū)域互作的位點是聚合酶 α亞基的 羧基端結(jié)構(gòu)域 (αCTD)，缺失 αCTD 時可阻止 CAPcAMP介導(dǎo)的激活作用； 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? ⑥ 對 DNA、 CAPcAMP和 RNA聚合酶 αCTD復(fù)合體進行 x射線晶體結(jié)構(gòu)分析，顯示盡管 CAP與 RNA聚合酶的界面不大，但激活區(qū)域 1確實是與 αCTD相接觸著。 ? Benoff et al. , Science 297 ? 169。 ? 利用不同構(gòu)型的 DNA遷移率不同的特點，制備lac操縱子的 DNA片段，各片段的長度相同，但CAP結(jié)合位點不同。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 如果 CAP的結(jié)合不會使 DNA彎曲，則所有 DNA片段應(yīng)具有相同電泳遷移率。這種彎曲是復(fù)合體中 DNA與蛋白質(zhì)發(fā)生最佳相互作用所必需的。(引自 : Adapted from Busby, S. and R H. Ebright, Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in prokaryotes, Cell 79: 742, 1994. ) 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 4 阻遏蛋白作用機制 （ 1）阻遏蛋白識別并特異結(jié)合 DNA的方式 通過提純能結(jié)合義務(wù)誘導(dǎo)物 IPTG的方法可分離得到阻遏蛋白。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 阻遏蛋白識別操縱基因特異序列是通過識別位點，共同特點是 具有對稱性。 ? 靠近對稱軸的一對反向重復(fù)序列在阻遏蛋白結(jié)合過程中起主要作用。 ? 用分析聚合酶與啟動子相互作用的方法可以鑒定阻遏蛋白與操縱基因作用的位點。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 許多研究都表明阻遏蛋白具有對稱性結(jié)構(gòu)，是相同亞基組成的四聚體 ，每個亞基有同樣的DNA結(jié)合位點。 ? 一個 α螺旋插入 DNA雙螺旋大溝，特異性識別幷以氫鍵形式結(jié)合于 DNA序列上。 誘導(dǎo)物的結(jié)合使阻遏蛋白變構(gòu)，從操縱基因上釋放，體外實驗發(fā)現(xiàn)，加入 IPTG能很快引起阻遏蛋白與操縱基因的復(fù)合物不穩(wěn)定 阻遏蛋白 IPTG復(fù)合物與 DNA接觸的方式與游離阻遏蛋白與 DNA接觸的方式相同。 ? 因此， 阻遏蛋白與 DNA親合力的變化是結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)整個構(gòu)型改變的結(jié)果， 而不是形成和打斷一個或少數(shù)幾個化學(xué)鍵所造成的。 ? 后來發(fā)現(xiàn)，阻遏蛋白和 RNA聚合酶可同時與DNA結(jié)合，且阻遏蛋白與 DNA的結(jié)合能夠增強 RNA聚合酶結(jié)合 DNA的能力。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? RNA聚合酶單獨結(jié)合 lac啟動子的平衡常數(shù)是 107LS1。mol1 ? 說明聚合酶結(jié)合啟動子的機會增加了近百倍。 ? 當(dāng)加入誘導(dǎo)物后，釋放出阻遏蛋白，關(guān)閉的復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開放的復(fù)合物，起始轉(zhuǎn)錄。 ? 如 λ噬菌體，操縱基因位于啟動子上游區(qū)，阻遏蛋白的結(jié)合阻礙 RNA聚合酶結(jié)合。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 阿拉伯糖操縱子 （ 1） 阿拉伯糖操縱子概述 阿拉伯糖操縱子（ Arabinose operon）是利用同一調(diào)節(jié)蛋白的不同結(jié)構(gòu)形式，活化和抑制操縱子的調(diào)控單位?？蔀榧毦毎x提供碳源。分別編碼 3種酶：核酮糖激酶， L阿拉伯糖異構(gòu)酶， L核酮糖 5磷酸差向異構(gòu)酶。 ? 另外，還包括調(diào)節(jié)基因 araC、操縱基因 araO、啟動子 araP，以及離這個基因簇較遠的兩個負責(zé)將阿拉伯糖運入細胞的蛋白基因 araE和araF，分別編碼一個膜蛋白和一個位于細胞間質(zhì)的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。三個結(jié)構(gòu)基因 araBAD由共同的啟動子 PBAD啟始轉(zhuǎn)錄；激活區(qū) araI位于 PBAD啟動子的上游。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 阿拉伯糖操縱子是可誘導(dǎo)操縱子，它本身就是誘導(dǎo)物。 ? 在腺苷酸環(huán)化酶缺陷型 crp的突變株也不形成 araBAD mRNA，由此證明從 PBAD起始的轉(zhuǎn)錄過程需要 cAMPCAP協(xié)助。 ara操縱子的操縱基因受 AraC蛋白調(diào)節(jié)。 Pr和 Pi兩種構(gòu)象處于相對平衡中。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 當(dāng)誘導(dǎo)物阿拉伯糖存在時 （正調(diào)控） 由 araC編碼的激活蛋白 AraC與阿拉伯糖結(jié)合成復(fù)合物，AraC構(gòu)象變?yōu)檎T導(dǎo)型 Pi ， AraC以二聚體形式與 araI1和 araI2結(jié)合，失去與 araO2結(jié)合能力，由此打開啟動子，使聚合酶結(jié)合， 激活 PBAD轉(zhuǎn)錄； 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 當(dāng)缺乏阿拉伯糖時 （負調(diào)控） AraC處于阻遏型 Pr構(gòu)象，不結(jié)合 araI，而結(jié)合操縱基因 araO2，使DNA彎曲， 阻礙 araBAD的表達。 ? 當(dāng) AraC蛋白以正調(diào)節(jié)因子作用時，起始轉(zhuǎn)錄還需要cAMPCRP的參與。 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖時， ara操縱子也存在葡萄糖效應(yīng)。 ? araO2如何調(diào)控位于其下游 250bp的啟動子轉(zhuǎn)錄 ? ? 合理的解釋是這兩個位點 (操縱基因和啟動子 )之間的 DNA發(fā)生環(huán)化。 ? 而如果插入非整數(shù)雙螺旋轉(zhuǎn)角 (如 5bp和 15bp)的DNA片段時，操縱基因就不能行使其功能。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 事實上， ara操縱子的調(diào)控蛋白 AraC是個雙功能蛋白，既可作為正調(diào)蛋白又可作為負調(diào)蛋白 ? AraC在操縱子上有 3個結(jié)合位點： ? 位于上游遠端 –280的 araO ? 定位在 –106和 –144之間的 araO1及由 2個半位點araI1(–56~–78)和 araI2 (–35~–51)組成的 araⅠ ，每個位點均可結(jié)合 1個 AraC單體。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 當(dāng)阿拉伯糖存在時，就與 AraC蛋白結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變，不能與 araO2結(jié)合，但能結(jié)合 araI1和 araI2，使 阻遏環(huán) （ repression loop） 解開， araO2 和araI1間的 DNA不再彎曲，操縱子去阻遏(圖 )， PC處的轉(zhuǎn)錄也正常進行。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 阿拉伯糖操縱子的調(diào)控機制示意圖 (引自： Robert F. Weaver. Molecular Biology (4th Edition) CAPcAMP復(fù)合體結(jié)合在 araPBAD啟動子的上游 , CAPcAMP在 araPBAD啟動子較遠的位置結(jié)合，但能調(diào)控轉(zhuǎn)錄，這是 DNA成環(huán)的第二個作用，環(huán)化 DNA使 CAP與 RNA聚合酶接近，促進了 RNA聚合酶與啟動子結(jié)合。隨著 AraC蛋白含量的不斷增加， AraC結(jié)合在 araO1上，抑制 araC的轉(zhuǎn)錄，防止阻遏物過多積累，這種蛋白質(zhì)控制自身合成的機制稱為 自主調(diào)節(jié)(autoregulation)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 小結(jié) ara操縱子 ： ① 有 araO1和 araO2兩個操縱基因， araO1調(diào)控基因 araC轉(zhuǎn)錄， araO2位于其所控制的啟動子 PBAD上游遠端，發(fā)揮控制轉(zhuǎn)錄的功能； ② CAP結(jié)合位點位于 ara啟動子上游，有促進轉(zhuǎn)錄的功能； ③ 有由 AraC蛋白介導(dǎo)的負調(diào)控系統(tǒng)。 AraBAD基因簇及 araC基因轉(zhuǎn)錄被協(xié)同調(diào)節(jié)。 AraC蛋白合成受其自身和 cAMPCAP調(diào)節(jié)。 CAP蛋白能協(xié)助解開因 AraC與 araO2和 araI1結(jié)合所形成的 DNA彎曲，使 AraC與 araI1和 araI2結(jié)合，激活 PBAD起始的轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? Trp的合成分 5步完成 每步需要一種酶，編碼 5種酶的基因緊密連鎖，轉(zhuǎn)錄在一條多順反子 mRNA上，分別編碼： ? 鄰氨基苯甲酸合成酶、 ? 鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、 ? 鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、 ? Trp合成酶和 ? 吲哚甘油 3磷酸合成酶， ? 以 trpE、 trpD、 trpC、 trpB、 trpA表示 ? TrpE 是第一個被翻譯的基因，和 trpE 緊鄰的是啟動子區(qū)和操縱子區(qū) 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 1 色氨酸操縱子的 阻遏系統(tǒng) ? Trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因 trpR距 trp基因簇較遠，編碼合成一個 58 KD阻遏蛋白，當(dāng)以游離形式存在時 ,不能結(jié)合到操縱基因上，此時，后者能夠轉(zhuǎn)錄和表達，使細菌細胞合成Trp。 這種調(diào)控方式容易造成： Trp存在時 ,Trp阻遏蛋白復(fù)合體結(jié)合操縱基因，完全阻斷轉(zhuǎn)錄， Trp缺乏時， 阻遏被消除，轉(zhuǎn)錄開放 ,合成 Trp ，不易保持細菌細胞 Trp水平的穩(wěn)定。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)區(qū)域的分布圖 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 由 Trp操縱子堿基序列可見 : 啟動子與操縱區(qū)域有很大程度的重迭 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 ? 造成 Trp 阻遏蛋白復(fù)合體與 RNA聚合酶結(jié)合DNA具有競爭性 ,體外實驗發(fā)現(xiàn)： ? 先加入 Trp 阻遏蛋白復(fù)合體， RNA聚合酶不能與啟動子結(jié)合，否則反之 . ? Trp操縱子的 阻遏系統(tǒng) 是 Trp生物合成途徑的第一水平調(diào)控 ， 主控轉(zhuǎn)錄的啟動與否 。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達調(diào)控 2 Trp操縱子 弱化系統(tǒng) 【 第二水平調(diào)控 】 在 TrpmRNA5ˊ 端 trpE起始密碼子前有一段 162bp的 DNA序列和核糖體結(jié)合