【正文】 蛋白之間加入一段可被蛋白酶識別的氨基酸序列，如 IleGluGlyArg可被溶血因子 X?識別并在 C端切開，并且這一段序列在自然狀態(tài)下很少出現(xiàn)，因此可以用于分割融合蛋白； （ 2）在胰島素中沒有 Met，因此在基因工程胰島素和宿主蛋白之間可以加入一個 Met，而表達的融合蛋白的 Met在體外可以被 CNBr轉移性識別和切割，從而形成 2條多肽鏈， 1條是胰島素，另 1條是宿主多肽。 （八）單一方向串連排列的基因 在低拷貝質粒中表達多個串連排列的基因，以增加蛋白的表達量。決定于： （ 1） 二硫鍵 形成情況。 （ 3）在可能的情況下，改變蛋白質中的 “ PEST”序列，但這種改變不能影響蛋白質的功能。 A、雙交換的發(fā)生： 僅目的基因整合到染色體上 B、單交換： 整個質粒整合到染色體上 使用 Marker可以很方便 地篩選整合重組菌株 ?淀粉酶基因整合到染色體上的拷貝數(shù)與未發(fā)生整合但由多 拷貝質粒攜帶時表達活性的比較 （十一）外源蛋白的分泌 分泌途徑： （ 1） 分泌到周質區(qū)（周質空間） ； （ 2）完全分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。 在大腸桿菌中所表達的外援蛋白大部分都是以包含體的形式存在。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 ② 尿素和鹽酸胍 ：對包含體的氫鍵有較強的可逆變性作用。 鹽酸胍的溶解效率很高，可以達到 95％以上，且溶解速度快，因而不會對外源蛋白進行共價修飾。 一般等電點處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質應首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質可以選用不同的特異性親和配基。 一般等電點處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質應首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質可以選用不同的特異性親和配基。 PEG化的途徑： （ 1）用氰脲酰氯、 N羥基丁二酰等活化的 PEG可以與氨基發(fā)生反應； （ 2）用馬來酸酐和 ?氨基乙酸活化的 PEG可以與巰基進行反應； （ 3） PEG可以與蛋白質的羧基發(fā)生反應。 多種分離純化技術的綜合運用 （ 1）應選擇不同分離純化機理的方法共同使用； （ 2）應首先設法除去含量最多的雜質； （ 3）要盡量采用高效分離方法； （ 4）要把最費時、成本最高的分離方法安排在最后的階段 選擇合適的分離純化材料 要求： （ 1） 有較高的分離效率； （ 2）在分離純化過程中不會造成目的蛋白的變性； （ 3）化學和機械性能穩(wěn)定，重復性好； （ 4）成本較低 分離純化過程的規(guī)?；? 規(guī)?；梢越档统杀?。 針對不同性質的蛋白質選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點的蛋白質。 一般變性時要考慮以下幾方面的因素： ① 變性劑的濃度及變化率； ② 外源蛋白的濃度及其純度； ③ 氧化還原劑的選擇； ④ pH值的選擇； ⑤ 適當?shù)碾x子強度； ⑥ 合適的溫度和作用時間； ⑦ 分子伴侶的作用（ chaperone） （二）表達蛋白純化的基本原則 針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略； （ 1）對于體積大、濃度低的分泌蛋白體系，先通常先要進行濃縮處理， 如沉淀、超濾； （ 2）可溶性表達產(chǎn)物先用親和層析法進行純化； （ 3）對于在壁膜間隙中表達的蛋白介于分泌性蛋白和細胞內可溶性蛋白兩者之間，可以先用 低濃度溶菌酶 處理，再用滲透壓休克法進行純化； 針對不同性質的蛋白質選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點的蛋白質。在復性后不會造成蛋白質的嚴重損失，同時還可以選用多種層析方法對提取到的包含體進行純化。 ① SDS：是曾經(jīng)廣泛使用的溶解劑，可以在低濃度（ 1％）下使包含體溶解。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。 （ 2） C端有分泌信號的蛋白： ?溶血素（ ?hemolysin） : 可完全分泌到培養(yǎng)基中。 （十）將外源基因整合入染色體上 （ 1） 相對穩(wěn)定地存在，沒有選擇壓力時也可長期保存 ； （ 2）外源基因的整合位點不能位于對宿主菌特別重要的基因內部； （ 3）一般整合到染色體上的目的基因最好也是由可調控的啟動子進行調控。一般可以通過在 N端增加 1個或幾個氨基酸，來使蛋白質的半衰期延長。 （九）增強蛋白質的穩(wěn)定性 構建和表達長半衰期的外源蛋白。 融合蛋白的應用 （ 1）在大多數(shù)情況下，融合蛋白本身就是很好的終產(chǎn)物，無需處理，如可以用融合蛋白來制備抗體； （ 2）由于融合蛋白的某些功能單元，可以用于簡化提純步驟。 pPC?載體組中每一個載 體 lacZ啟動子、 SD序列和 lacZ 基因的前 8個氨基酸編碼序 列，在 lacZ的下游有 1個 EcoRI位點； pPC???Z1的 EcoRI位點保 持不變，其末端為 G?？梢詫?pin同時克隆到質粒載體上。如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）蛋白酶活性強，而且具有外分泌性，但短