【正文】 原的另一抗原決定簇結(jié)合 ,形成固相抗體 抗原 標(biāo)記抗體復(fù)合物 ,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體 ,測定固相上的放射性。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 IRMA與 RIA的異同點 ? 標(biāo)記物 在 RIA中 核素標(biāo)記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素標(biāo)記抗體。抗體為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)記，不同抗體標(biāo)記方法基本相同。標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。 ? 反應(yīng)速率 反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在 IRMA中標(biāo)記抗體是過量的，而且不存在競爭性結(jié)合復(fù)雜的反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較 RIA快。在 RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在 IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結(jié)果。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 ? 反應(yīng)原理 RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。 IRMA為非競爭結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)的直線關(guān)系。 ? 特異性 在雙位點 IRMA中，一般均應(yīng)用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。 ? 檢測范圍 通常 RIA的工作范圍為 23個數(shù)量級，而RIMA可達 3個數(shù)量級以上。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 ? 分析誤差 RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴(yán)重影響測定結(jié)果。 IRMA中標(biāo)記和固相抗體在反應(yīng)中都是過量的，只有受檢標(biāo)本的加樣誤差才會影響分析結(jié)果。因此， IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。 ? 其他 RIA可以測定大分子量與小分子量的物質(zhì)，雙位點IRMA只能測定在分子上具有 2個以上抗原表位的物質(zhì)。在RIA中應(yīng)用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。 IRMA中標(biāo)記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 放射免疫技術(shù)的應(yīng)用 常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。 問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長不易自動化儀器分析等。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 第九章 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù) (immunofluorescence technique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。 是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 基本原理 利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 第一節(jié) 熒光的基本知識 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 異硫氰酸熒光素（ FITC） 為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為 ，最大吸收光波長為 490495nm，最大發(fā)射光波長 520530nm，呈現(xiàn)明亮的 黃綠色熒光 ，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。 主要優(yōu)點：①人眼對黃綠色較為敏感；②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色， 降低背景干擾 。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 四乙基羅丹明（ RB200） 為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為 595－ 600nm，呈橘紅色熒光 。常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧? 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 四甲基異硫氰酸羅丹明（ TRITC） 最大吸引光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為 620nm，呈 橙紅色熒光 。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 熒光抗體的制備 作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求 ： ①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。 ②熒光效率高 ,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。 ③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。 ④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。 ⑤標(biāo)記方法簡單、安全無毒。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 熒光抗體是將熒光素（如 FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價結(jié)合而成。 標(biāo)記方法：攪拌法 (適合大樣品 ) 透析法 (適合小樣品 ) 標(biāo)記抗體的純化：透析法 層析分離法 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 熒光抗體的鑒定 F/P比率 ： 將制備的熒光抗體稀釋至 A280≈ ，分別測讀 A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 F/P值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以 F/P＝ ，用于活細胞染色的以 F/P＝ 。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 抗體效價 ：效價越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在 1:161:32者較為理想 抗體特異性 ：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉