【正文】 巴比妥鈉 克 蒸餾水 1000 毫升 ，離子強度 (M) 6．其它：載物玻片，直徑 3 毫米打孔器， 20mmⅹ 2mm玻璃鑄型，微量進樣器。 方法： (ⅹ 厘米 )加上 毫升 %瓊脂凝膠，制成 2 毫米厚的瓊脂板。 圖位置，在瓊脂板未凝固時，放入抗血清槽鑄型，注意勿使鑄型全部浸入瓊脂中，待凝固時再打孔。 ：用微量進樣器往孔中加 1— 5 微升。 ：電壓 9— 7 伏 /厘米，泳動 15— 20 小時。 ，加入抗血清，進行雙擴散，一般在 24小時內(nèi)沉淀弧出全。 6．觀察結(jié)果：或描繪、拍照或進行染色，染色后的標本便于結(jié)果分析及保存。 圖 6 免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖 (五 )火箭電泳試驗 火箭電泳實際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場作用下，抗原在含定量抗體的瓊 脂介質(zhì)中泳動，二者比例在合適時在較短時間內(nèi)形成狀似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關(guān)系，因此本法可以測定樣品中抗原的含量。 材料： 1．診斷血清 (抗體 )：抗人 IgG或 IgA 免疫血清 2．待檢血清 (抗原 )：人血清 3．參考血清 4． ，離子強度 巴比妥緩沖液配制 (見對流免疫電泳試驗 ) 5．其它：瓊脂粉，微量進樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀 方法： 1．抗體瓊脂板的制備 同單向擴散法，但注意稀釋液應(yīng)用 離子強度 的巴比妥緩沖液。 2．打孔見下圖 圖 7 火箭電泳抗原孔位置圖 3．將用緩沖液稀釋的適宜濃度的參考血清及適當(dāng)稀釋的抗原 (人血清 )分別加入各孔中，每孔 10 或 20 微升，要求加量準確而不外溢。 4．把加完樣的免疫瓊脂板放入電泳槽中進行電泳，電壓 4— 6 伏 /厘米，電泳時間 1— 5 小時，直到大部分抗原孔前端出現(xiàn)頂端尖窄而完全閉合的火箭狀沉淀線，關(guān)閉電源。 5．取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點，量出各火箭狀沉淀線的高度。同單向瓊脂擴散法繪制標準曲線，查出待檢血清中 Ig 含量。 實驗三 凝集反應(yīng) 當(dāng)顆粒性抗原與其相應(yīng)抗血清混合時，在有一定濃度的電解質(zhì)環(huán)境中，抗原凝集成大小不等的凝集塊，叫做凝集反應(yīng)。 凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。即可用已知免疫血清來檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測特異性抗體。 一．直接凝集反應(yīng) 顆?？乖c抗體直接結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象叫直接凝集反應(yīng)。 (一 )玻片凝集反應(yīng) 材料： 1．診斷血清： 1： 10 稀釋的傷寒桿菌診斷血清 2．菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌 24 小時瓊脂斜面培養(yǎng)物 3．生理鹽水、載玻片、毛細吸管 方法： 1．取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。無菌 操作下，用接種環(huán)于 2 格內(nèi)加 1： 10 稀釋傷寒桿菌診斷血清 12 滴，第三格加 12 滴生理鹽水。 2．無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，再混于第一格中 (不能先混第一格再混第三格，因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結(jié)果 )，將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。 3．同法取枯草桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。 4．輕輕搖動玻片，經(jīng) 12 分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，即為陽性反應(yīng)；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。如結(jié)果不夠清晰，可將玻片放于 低倍顯微鏡下觀察。 (二 )試管凝集反應(yīng) 為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相對含量。 材料： 1．診斷血清 1： 10 稀釋傷寒桿菌“ H”血清， 1： 10 稀釋傷寒桿菌“ O”血清。 2．菌液：傷寒桿菌“ H”菌液，傷寒桿菌“ O” 菌液。 3．生理鹽水，小試管，吸管。 方法： 1．取潔凈小試管 14 只分兩排排列于試管架上，每排 7 只依次用蠟筆注明號碼，于每管中分別加入 毫升生理鹽水。 2．在第 1 排 1 管中加入 1： 10 稀釋傷寒 H 血清 毫升，于管內(nèi)連續(xù)吹吸 3 次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出 毫升注入第 2 管，同樣予以混勻后吸出 毫升注入第 3 管。依次類推，稀釋到第 6 管，自第 6 管吸出 毫升棄去。此時，自第 1管至第 6 管的血清稀釋倍數(shù)為 1： 20， 1： 40， 1： 80， 1： 160， 1： 320， 1： 640。第 7 管不加血清作為對照。 3．同法用吸管吸取 1： 10 稀釋傷寒桿菌 O 血清加入第 2 排第 1 管，并依次如上法予以稀釋。 4．用移液管吸取傷寒桿菌 H菌液，加收第 1排各管中每管 (由鹽水對照管開始，依次由后向前加入 )此時血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。 5．同法于第 2 排各管中加入傷寒 O 菌液 毫升。 6． 將各管振蕩混勻，放 37℃水浴箱中 2— 4 小時或 37℃孵育箱中過夜次日取出觀察結(jié)果。 觀察結(jié)果： 1．觀察切勿搖動試管，以免凝集塊分散。 2．先看對照管，此管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。但如放置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反應(yīng)。 3．試驗管應(yīng)自第 1 管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“ +”號表示如下： “ ++++”凝集很強，管內(nèi)液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底； “ +++”凝集強，管內(nèi)液體不完全澄清稍有輕度混濁，凝集塊沉 于管 底； “ ++”凝集中等強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底； “ +”凝集弱，管內(nèi)液體混濁，少量凝集塊沉于管底； “－”不凝集，管內(nèi)液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。 4．輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細菌在振蕩時呈煙霧狀上升，隨即消散，細菌分散仍呈混濁狀態(tài)。“ H”菌液的凝集塊疏松呈棉狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎?！?O”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。 5．記錄觀察的結(jié)果并制定凝集效價。通常以能產(chǎn)生明顯凝集 (++)的血清大稀釋倍數(shù)作為該血清的 凝集效價。如血清的最低稀釋度 (即第1 管 1： 40)仍無凝集應(yīng)報告為低于 1： 40。如血清的最高稀釋度 (即第6 管 1： 1280)仍顯完全凝集現(xiàn)象。，應(yīng)報該血清效價高于 1： 1280。 二．間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)比直接凝集反應(yīng)敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。 (一 )間接血球凝集試驗 間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為 “致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應(yīng)的抗血清相遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。 間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質(zhì)浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質(zhì)時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。 材料： 1．抗原 — 傷寒桿菌 O 抗原 2．免疫血清：傷寒桿菌 O901 免疫兔血清 3． 25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等 方法： 1．“ O”抗原的制備： 將每毫升 100 億的傷寒桿菌“ O”菌懸液，置 100℃水浴中 2 小時，離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放 4℃冰箱備用。 2． 致敏紅血球懸液制備： 取一定稀釋度的抗原加等量 %綿羊紅血球懸液，混合后放 37℃水浴箱中，每隔 15 分鐘取出振搖一次，共經(jīng) 2 小時。然后取出，用生理鹽水洗滌 3 次，而配制成 %懸液即成。 3．試驗步驟： (1)小試管 9 只標好號碼于試管架上。 (2)第 1 管加入 毫升生理鹽水，其余各管各加入 毫升。 (3)以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清 毫升加入第 1 管，混勻后吸取 毫升注入第 2 管，同樣第 2 管的血清與鹽水混勻后吸取 毫升注入第 3 管。如此依次稀釋直至第 8 管。自第 8 管吸出 毫升棄去。第 9 管不 加血清作對照。 (4)于每管加入 毫升已經(jīng)致敏的 %綿羊紅血球懸液，混勻后放入 37℃水浴中 2 小時后觀察結(jié)果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現(xiàn)完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。 (二 )間接凝集抑制試驗 若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先混合，充分作用后再加入有關(guān)的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。 妊娠試驗： 孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當(dāng)往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時 ，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體被消耗，此時再往尿中加入膠乳抗原 (吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒 )。不發(fā)生反應(yīng)，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少 (非妊娠尿 )不足以把加入的抗體消耗，當(dāng)膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。出現(xiàn)均勻細小顆粒，妊娠試驗為陰性。 材料： 1．抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原 2．抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清 3．被檢材料：孕婦尿 4．正常尿作對照用 5．黑反應(yīng)板 1 塊 6．滴管 3 只 方法： 1．用 清潔滴管在反應(yīng)板上滴加一滴被檢尿。 2．再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。 3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動 3— 5 分鐘，在較強光線下，觀察結(jié)果。出現(xiàn)均勻一致的細小顆粒為陰性反應(yīng)，懷孕。 注意事項： 1．試驗材料用具用前使溫度接近室溫 (20℃左右 ) 2．被檢尿太混濁，需要小心過濾。 3．尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。 (三 )協(xié)同凝集試驗 金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的 A 蛋白能與人及多種哺乳動物 (豬、兔、羊、鼠等 )血清中 IgG 類抗體 的 Fc 段結(jié)合。 IgG 的 Fe 段與 SpA結(jié)合后，兩個 Fab段暴露在葡萄球 體表面，仍保持其抗體活性和特異性當(dāng)其與特異性抗原相遇時，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應(yīng)中，金黃色葡萄球菌菌體成了 IgG 抗體的載體 ,稱為協(xié)同凝集反應(yīng) .本反應(yīng)也可用于檢測微量抗原 . A. 材料： 1. 抗原 :可溶性傷寒桿菌 O 抗原 2. 免疫血清：傷寒桿菌 0901 免疫兔血清 3. 10%CoWan1 株金黃色葡萄球菌 (含大量蛋白 A)的菌液 4. %甲醛 PBS，吸管、滴管、玻片等 B. 方法： 1． 10%葡萄球菌菌懸液的制備： CoWan1 株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng) 1824 小時，用 PBS 洗下菌苔，每分鐘 2500 轉(zhuǎn)速度離心 20分鐘。沉淀菌用 PBS 洗兩次后，用 %甲醛 (用 PBS 配置 )在室溫中固定 3 小時。置于 80℃水浴中 4 分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再用 PBS 洗滌 2 次后配成 10%菌懸液。 2．致敏葡萄球菌： 1 毫升 10%的菌懸液加 毫升傷寒 O 抗血清充分混合放入 37℃水浴中 30 分鐘 (中間需搖動兩次 )。取出后經(jīng)每分鐘 2500 轉(zhuǎn)速度離心 20分鐘，棄去上清液，沉淀菌用 PBS 洗滌 2 次后配成 10%菌懸液。 3．協(xié)同凝集試驗 ?取傷寒“ O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約 2 分鐘。一般在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生凝集。 ?滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒 O 菌培養(yǎng)物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約 2 分鐘，記錄有無凝集。 ?用傷寒“ O”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養(yǎng)物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應(yīng)，不出現(xiàn)凝集。 三．凝集吸收 腸道桿菌中的許多細菌都有部分相同的抗原結(jié)構(gòu)。因之一種細菌可與另一種細菌相應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。用一種過量的細菌抗原與發(fā)生交叉凝集反應(yīng)的抗血清相結(jié)合。可將 其共同抗體吸去，剩下抗體只能與特異性抗原起反應(yīng)，這種試驗即稱凝集吸收試驗。 利用凝集吸收試驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原結(jié)構(gòu)的分析及鑒定菌型。 材料： 1. 免疫血清： 1： 10 稀釋傷寒桿菌免疫血清。 2. 菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。 3. 試管、吸管、毛細吸管。 方法： 1. 1/10 稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進行玻片凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共同抗原結(jié)構(gòu)，故發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。 2. 將一定量的 腸炎桿菌菌液加入 1： 10 稀釋傷寒桿菌免疫血清中，放 37℃水浴箱中作用 2 小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。 3. 將吸收過的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結(jié)果。如仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進行吸收，方法如上。 4. 重復(fù)吸收過的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進行玻片凝集。如與