【正文】 分析方法的選擇 分析方法學(xué)驗證的內(nèi)容分析方法建立實例分析分析方法的選擇1. 根據(jù)分析對象的性質(zhì)選擇準(zhǔn)確、可靠的方法2. 分析方法的科學(xué)性，應(yīng)根據(jù)分析方法的評價參數(shù)選擇可以滿足分析需要的分析方法3. 分析方法的實用性，方法應(yīng)簡便易行，樣品前處理少、操作不費時、適合大批量樣品的測定、同時測定成本低、所用試劑和材料不特殊、種類少、穩(wěn)定性高、環(huán)保、毒性小等。4. 方法要經(jīng)過驗證和評價分析方法學(xué)驗證的內(nèi)容1. 精密度2. 準(zhǔn)確度3. 靈敏度4. 檢測限5. 檢測上限6. 定量限7. 方法的適用范圍8. 最佳測定范圍9. 選擇性和專屬性10. 耐用性11. 不確定度評估精密度(precision)1. 在一定條件下對同一被測物多次測定的結(jié)果與平均值偏離的程度。精密度反映了隨機誤差的大小。常用標(biāo)準(zhǔn)差（S）或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。u平行性（replicability）相同分析方法、樣品、實驗室、分析人員、分析設(shè)備、分析時間u重復(fù)性（repeatability）相同分析方法、樣品、實驗室，但分析人員、分析設(shè)備、分析時間中至少有一項不同u再現(xiàn)性（reproducibility）相同分析方法、樣品，但實驗室，分析人員、分析設(shè)備、分析時間均不同精密度平行性重復(fù)性再現(xiàn)性備注方法√√√樣品√√√地點√√人員√√時間√√分散設(shè)備√√濃度水平333樣品（n）999室內(nèi)室間準(zhǔn)確度（accuracy）析結(jié)果與假定的或公認(rèn)的真實值之間符合程度的度量。機誤差的綜合指標(biāo)。準(zhǔn)確度的評價方法回收率X1X0P（%）= ————100MP ——加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率M——加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量X1——加入標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定值X0——未知樣品的測定值用回收率評價準(zhǔn)確度需注意事項1. 不同濃度水平，加入量與樣品濃度相近（80%、100%、120%），不能超過方法的線性范圍，加標(biāo)量不得超過待測物含量的3倍。2. 用回收率評價準(zhǔn)確度并非完全可靠。形態(tài)不同、與其它組分的關(guān)系不同。3. 選定與被測樣品相似的標(biāo)準(zhǔn)參考物更加可靠。4. 樣品中某些組分對被測成分產(chǎn)生的干擾（正、負(fù)），有時很難靠回收率實驗發(fā)現(xiàn)。5. 如果可能，用不同方法比較。靈敏度（sensitivity）濃度或單位量的待測物質(zhì)的變化所引起的響應(yīng)量變化的程度。通常工作曲線的斜率（k）用于度量靈敏度。A=kc+a檢測限（limitofdetection,LOD）信水平內(nèi)可以從樣品中檢測到待測物質(zhì)的最小濃度或最小量。即分析方法所能識別的極限。分光光度法檢測限的確定應(yīng)的濃度值為檢測限。2. 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量= ————————————4. 標(biāo)準(zhǔn)吸光度空白吸光度色譜法檢測限的確定以最低檢出量（或濃度）表示檢測限。S=3NS——最小響應(yīng)值（峰高或峰面積）N——噪音信號標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量S最低檢出量= ————————————標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)值注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量盡量接近最低檢出量，較為準(zhǔn)確。檢測上限（maximumdetectability）指與標(biāo)準(zhǔn)曲線直線部分最高界點相應(yīng)的濃度值。當(dāng)樣品中待測物質(zhì)的濃度值超過檢測上限時，無法定量。定量限（limitofquantitation,LOQ）1. 定量下限：u在限定誤差能滿足要求的前提下，用特定分析方法能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的最小濃度或量。通常取SN=10Nu對于消除了系統(tǒng)誤差的特定方法來說，精密度要求越高，則定量下限高出檢測限越多。2. 定量上限：u在限定誤差能滿足要求的前提下，用特定分析方法能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的最大濃度或量。u對于消除了系統(tǒng)誤差的特定方法來說，精密度要求越高，則定量上限低于檢測上限越多。方法的適用范圍的濃度范圍，在此范圍內(nèi)可作定性或定量的測定。最佳測定范圍（optimumconcentrationrange），在限定誤差能滿足要求的前提下，特定方法的測定下限至測定上限之間的濃度范圍。在此范圍內(nèi)能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的濃度或量。，對測量結(jié)果的精密度要求越高，則相應(yīng)的最佳測定范圍越小。檢測上限定量上限斜率K=靈敏度定量下限檢測限最佳測定范圍方法適用范圍選擇性和專屬性的測定方法組成的。耐用性在測定條件有小的變動是，測定結(jié)果不受影響的承受程度。u樣品溶液的穩(wěn)定性u提取次數(shù)、時間uHPLC流動相比例、PH、……（五）、分析方法建立實例分析實例1高效液相色譜法測定保健食品中的淫羊藿苷高效液相色譜法測定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood1范圍本方法規(guī)定了保健食品中淫羊藿苷的測定方法。本方法適用于以淫羊藿或淫羊藿提取物為主要原料生產(chǎn)的保健食品中淫羊藿苷的測定。原理將粉碎的膠囊內(nèi)容物、丸劑或液體試樣經(jīng)提取、濃縮等前處理后，根據(jù)高效液相色譜紫外檢測器定性定量檢測。試劑除非另有說明，在分析中僅使用重蒸水。（乙醇546mL→1000mL），加入甲醇溶解并定容至25mL。儀器高效液相色譜儀：附紫外檢測器（UV）。超聲波清洗器。高效液相色譜法測定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood分析步驟試樣處理：固體試樣：取20粒以上膠囊、10g以上丸劑試樣進(jìn)行粉碎，混勻，根據(jù)樣品含量，～（），精密加入50mL稀乙醇，稱重，超聲提取60分鐘，取出，放冷至室溫，用稀乙醇補重，過濾，取續(xù)濾液。液體試樣：取100mL以上液體試樣，混勻，精密吸取50mL，減壓濃縮至近干，用稀乙醇轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。液相色譜參考條件 色譜柱：C18柱，5μm，250mm。 柱溫：20～35℃。 紫外檢測器：檢測波長270nm。 高效液相色譜流動相：乙腈水（26:74）。 流速：。 進(jìn)樣量：10～20181。L。 色譜分析：取10～20181。L試樣溶液注入色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰面積通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。高效液相色譜法測定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖高效液相色譜法測定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood～，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣量10181。L，以峰面積對進(jìn)樣量（181。g）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析結(jié)果的表述由y=a+bx得[（yxa）/b]V1103100X=MV2式中：X ——試樣中淫羊藿苷的含量，g/100g；yx ——試樣峰面積；V1 ——試樣稀釋倍數(shù)，mL；M ——試樣質(zhì)量，g；V2——樣品進(jìn)樣量，μg。技術(shù)參數(shù)%～%之間。允許差平行樣相對誤差≤2%。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證1儀器及試藥：附紫外檢測器（UV）。島津2010液相色譜儀；AgiLent1100液相色譜儀；島津2010/SPDM液相色譜儀。除非另有說明，在分析中僅使用重蒸水。純凈水為MilliQ純水系統(tǒng)二次制備。（乙醇546mL→1000mL）。：澳美制藥生產(chǎn)。：勁牌有限公司生產(chǎn)。：深圳市寶和堂保健品有限公司出品。：淫羊藿苷（批號：110737200414，中國藥品生物制品檢定所提供）。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證2樣品及處理：取10粒膠囊內(nèi)容物，混勻，精密稱定；或取10g丸劑，研細(xì)，混勻，精密稱定。精密加入稀乙醇50mL，稱重，超聲處理60分鐘，放冷至室溫，再稱重，加稀乙醇補足減失的重量。濾過，取續(xù)濾液。：取100mL以上液體試樣，混勻，精密吸取50mL，減壓濃縮至近干，用稀乙醇轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證3對照品，置25mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證4線性及范圍，1mL、2mL，分別置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL，2mL，3mL，5mL，10mL，分別置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按給定的色譜條件，分別精密吸取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（181。g）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：y=104，r=～，進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。（見附圖1）標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證1200000010000000800000060000004000000200000000 1 2 3 4 5 6淫羊藿苷進(jìn)樣量（μg）淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣量（μg）峰面積積分值216452428011850451120729921414143235671538747911020132峰面積標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證5檢測限和定量限（濃度為），置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，進(jìn)樣量10μL。此濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰高為相應(yīng)噪音的峰高的3倍。故本方法103μg。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證淫羊藿苷檢測限色譜圖標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證（濃度為），置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，進(jìn)樣量10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見下表。103μg。標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證定量限測定結(jié)果進(jìn)樣次數(shù)峰面積積分值平均值RSD%12455624412%224838324044424025524597標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證16小時內(nèi)穩(wěn)定性試驗結(jié)果6穩(wěn)定性取同一供試品溶液，按給定色譜條件測定16小時內(nèi)淫羊藿苷峰面積積分值，數(shù)據(jù)見表小時峰面積積分值平均值RSD%011954301181775%21171502411719506119025281164955101192283121181783141189009161178808標(biāo)準(zhǔn)起草說明和方法學(xué)驗證重復(fù)性試驗結(jié)果7精密度(批號:QLS050107)12份（低濃度3份，中間濃度6份，高濃度3份），按樣品溶液制備方法制備，依給定色譜條件測定含量試驗重復(fù)次數(shù)取樣量（g）含量（g/100g）平均值RSD%1%2