【正文】 ，將孔中的液體甩入廢液回收容器內。 3．用將近 300ul 一倍濃度的洗液洗滌每孔 4遍或更多次?；蛴?300ul 一倍濃度的洗液浸泡 2分鐘，然后將洗液甩掉。 4．在每孔中加入 100ul兔抗 p27辣根過氧化物酶結合物。 5．在室溫下孵育 60 分鐘。 6．重復第 3步。 7．在每孔中加入 100ul TMB底物溶液。 8．在室溫下孵育顯色 15 分鐘。 9．在每孔中加入 100ul終止液終止反應。 10．用空氣將酶聯儀調零。 11．在 650nm波長下測量并記錄標準對照孔和樣品孔的光吸收值。 12．計算結果。 解剖和病理 一．病理剖檢程序 1. 觀察病雞臨床癥狀。 2. 用注射器采病雞血液（較大雞：從翅膀 靜脈采；較小雞：從心臟采）放在采血管中并編號。 3. 處死病雞?？捎脭囝i法，或者用注射器經枕骨大孔腦內注射福爾馬林溶液的方法。一般用后一種方法。對于要取腦組織做病原分離的情況，則 只能用前一種方法。 4. 檢查病、死雞羽毛、皮膚、眼、鼻、喙等外表組織器官。 5. 仰臥雞只，用手術剪從腹側正中剖開皮膚，檢查皮下組織、肌肉（包括雛雞的胸腺等）。 6. 往兩側拉伸腿部，使髖關節(jié)脫臼，從而使雞尸體仰臥更穩(wěn)。 7. 用解剖刀切開胸肌，檢查深層胸肌及注射油苗情況。 8. 用解剖剪從龍骨左側打開胸腹腔，依次檢查 肝臟、心臟、氣囊、脾臟、性腺、腎臟、胃腸道及其內容物、法氏囊和胸腹腔璧等。 9. 檢查上消化道（口腔、食道和嗉囊）和呼吸系統（鼻腔、鼻竇、喉頭、氣管、支氣管和肺）。 10. 檢查全身骨、關節(jié)。 11. 檢查腦、神經。 12. 在北京家禽育種有限公司保健中心雞只尸體剖檢記錄表中詳細記錄病理剖檢結果。 13. 注意事項 : 根據具體情況，在剖檢過程中要適時選留適宜病料，以備做其他實驗室檢查用。 二．病理組織學檢驗程序 1. 采集病變組織及固定 : 用刀片將病變組織切成一定大小 (一般為 1?1厘米的 方塊，厚度不超過 米 )的方塊，放在 10%福爾馬林溶液 (福爾馬林溶液與病變組織的體積比不能低于 2:1)中固定 24 小時以上。對于特殊組織要做特殊的處理。如腦組織，要從腦正中垂直縱切后固定；消化道上皮等不定形的組織，要放在硬紙片上幫助定形后固定。對需要做標記的組織，要放在作上標記的硬紙片上用紗布包裹后固定。 2. 切片的制作 一般采用石蠟切片的方法。 組織水洗：將固定好的病變組織分成兩份，一份放回 10%福爾馬林溶液中作備份，另一份用紗布包裹后，用流水沖洗 56小時。 組織脫水：將組 織依次放在下列溶液中脫水，脫水時間依組織塊大小而定。組織塊較大，放置于每種溶液中的時間要長些；反之，則短些。 70%酒精溶液中 24小時； 80%酒精溶液中 24小時； 90%酒精溶液中 24小時； 95%酒精溶液中過夜； 100%酒精溶液中兩次，每次 12小時。 組織透明：用二甲苯透明。透明時間視組織塊大小和實際透明情況而定，一般不超過 1小時。只要組織塊經過肉眼觀察已經透明，應馬上取出進行下一步。 組織浸蠟：依次置于三種熔點不同的軟蠟中各 ，最后浸于硬蠟中。浸蠟時間視組織塊大小可做適當調整。 組織包埋：用不銹鋼勺取溶解的硬蠟和組織一起放在事先疊好的長方體形硬紙盒中包埋，待蠟塊完全凝固后進行下一步。 組織切片： 用切片機將石蠟包埋的組織切成一定厚度的薄片，厚度一般為 36微米。 在 3842℃的蒸餾水中進行展片，然后將展開的組織薄片附貼在涂有少量甘油蛋白的載玻片上。 將切片置于烤箱中烤干 (烤片溫度一般不超過 50℃，時間約 13小時 )。 石蠟切片的染色： 常用 蘇木素 伊紅染色法。必要時可用其他適宜的染色方法 (如 PAS皂黃染色法 )。 蘇木素 伊紅染色步驟 : . 二甲苯脫蠟 5分鐘； 100%、 95%、 90%、 80%、 70%酒精溶液中各放置 1分鐘； 15 分鐘 。 30分鐘，然后用鹽酸酒精分化液作用 1030秒鐘；繼續(xù)流水沖洗 1015分鐘； 25分鐘； ； 70%、 80%、 90%、 95%酒精溶液中脫水各 1分鐘；然后置于 100%酒精溶液中兩次 ，每次 23分鐘； 510 分鐘； ； 37℃溫箱中 2448 小時，烘干。 3. 切片的觀察 : 借助光學顯微鏡觀察組織切片的病理變化情況，記錄觀察結果。 三．雞病診斷程序 1要求送檢人員詳細填寫《北京家禽育種有限公司保健中心病例背景登記表》，保證填寫內容的真實性。 2詳細檢查北京家禽育種有限公司保健中心病例背景登記表中的各項內容，了解有關信息。必要時，需向飼養(yǎng)管理負責人了解其它有關情況，甚至親自到農場去觀察雞群的情況。 3檢查病雞群的血清學檢測結果。 4檢查病死雞的病理剖檢結果。 5檢查病變組織的病理組織學檢查結果。 6檢查病變組織的病原分離培養(yǎng)及鑒定結果。 7檢查其他有關化驗結果。 8綜合上述各項檢查結果作出診斷并出具報告。 四 . 抗生素檢驗程序 1. 材料 培養(yǎng)基：同藥敏試驗檢驗程序中的培養(yǎng)基。 試驗微生物：選擇診斷室保存的對待檢抗生素 (或其同類抗生素 )敏感的致病微生物株作為試驗微生物。一般選擇大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌四種常見致病菌作為試驗微生物。在實際檢驗過程中，應根 據抗生素的用途，選擇相應病原微生物作為試驗微生物。 稀釋液：用滅菌蒸餾水。 濾紙片：用打孔器將優(yōu)質濾紙片制成直徑為 6毫米的圓形紙片，經 121℃高壓蒸汽滅菌，干燥后密閉保存于 48℃冰箱中備用。 2. 方法： 根據《抗菌藥物藥敏試驗判定標準》中同類 (作用相同或相似 )抗生素藥敏試驗紙片含藥劑量，將待檢抗生素用滅菌蒸餾水稀釋成一定濃度的溶液或混懸液 (每 5微升液體含有 1片藥敏紙片中的抗生素量 )。 用經無菌蒸餾水浸濕的滅菌棉拭子取新鮮純培養(yǎng)的試驗微生物，均勻涂布于培養(yǎng)基上。 用無菌小鑷子取濾紙片平放在培養(yǎng)基表面。 用加樣器取 5微升混勻的待檢抗生素稀釋液加到培養(yǎng)基中的濾紙片上，待液體吸入濾紙片和培養(yǎng)基后，將平皿置于 37℃溫箱中培養(yǎng) 1618 小時。 按照藥敏試驗檢驗程序記錄結果，并判定試驗微生物對受檢抗生素的敏感性。 3. 結果判定： 根據控制病原微生物的要求，結合上述測試結果，判定受檢抗生素是否符合要求。 4. 出具抗生素檢驗報告。 藥敏試驗檢驗程序 1 材料： 1 1 培養(yǎng)基：一般用 WHO 推薦的 MH 培養(yǎng)基。對鏈球菌、嗜血桿菌等細 菌加適量（ 5%）的新鮮綿羊血制成平板。密封于塑料袋中，放 48℃的冰箱中保存（不超過 7 天）備用。 1 2 藥敏紙片：根據需要，從有合格證的生物制品制造單位購買。封存于 20℃冰箱中保存（使用期限以藥敏紙片制造單位所附的有效期為準）備用。 1 3 試驗菌：新鮮可疑帶菌病料，或者經過純培養(yǎng)的致病菌。 2 方法： 2 1 在無菌條件下，取新鮮無污染的可疑含菌臨床病料或經過純培養(yǎng)的致病菌均勻涂抹培養(yǎng)基表面。 2 2 以無菌鑷子夾取藥敏紙片貼放于培養(yǎng)基表面（每兩個藥敏紙片之間的及藥敏紙片與培養(yǎng)皿邊緣之間的 最短距離，視藥敏紙片所載藥物可能產生的抑菌圈大小而定，一般不少于 15 毫米）。 2 3 將培養(yǎng)皿放置于 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 1824 小時。 2 4 用直尺測量藥敏紙片周圍的抑菌圈大小并記錄結果。 2 5 如果在記錄結果時發(fā)現培養(yǎng)皿上沒有細菌菌落生長，或者細菌菌落生長不均勻，或者發(fā)現所有藥敏紙片的周圍沒有抑菌圈，則必需取經過純培養(yǎng)的致病菌，重復上述 2 1， 2 2， 2 3， 2 4 四個步驟一次。 3 結果判定： 根據《抗菌藥物藥敏試驗判定標準》加以判定。 備注： 有些品種藥敏紙片 的判定標準資料沒有，如阿莫西林、多粘菌素 E 等參照相關（作用相似）藥敏紙片的判定標準。 附：《抗菌藥物藥敏試驗判定標準》 抗菌藥物 代 紙片 抑菌圈直徑 (mm) 類 名 號 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 別 稱 微克 /片 （ R） （ M） （ S） 氨基 慶大霉素 Gentamycin GM 10 ≤ 12 1314 ≥ 15 糖甙類 新霉素 Neomycin N 30 ≤ 12 1316 ≥ 17 青 氨芐青霉素 Ampicillin AM 10 霉 當測試革蘭氏陰性腸內細菌 ≤ 13 1416 ≥ 17 素 當測試匍萄球菌 ≤ 28 ≥ 29 類 當測試腸球菌 ≤ 16 17 及 奧格門丁 Amoxicillin/Clavulanic Acid AMX/CA 20/10 其 當測試匍萄球菌屬 ≤ 19 ≥ 20 復合劑 當測試其他細菌 ≤ 13 1417 ≥ 18 頭 頭孢唑啉 Cefazolin CZ 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 孢 頭孢三嗪 Ceftriaxone CRO 30 ≤ 13 1420 ≥ 21 類 頭孢噻吩 Cephalothin CF 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 頭孢美唑 Cefmetazole CME 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 四環(huán)素 四環(huán)素 Tetracycline TE 30 ≤ 14 1518 ≥ 19 類 強力霉素 Doxycycline DO 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 大環(huán) 紅霉素 Erythromycin E 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 內酯類 柱晶白霉素 Leuycin LU 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 多 萬古霉素 Vanycin VA 30 肽 當測試腸球菌 ≤ 14 1516 ≥ 17 類 當測試革蘭氏陰性細菌 ≤ 9 1011 ≥ 12 磺 磺胺甲基異惡唑 Sulfamethoxazole SMX 300 ≤ 12 1316 ≥ 17 胺 類 復方新諾明 Sulfamethoxazole/Trimethoprim SXT ≤ 10 1115 ≥ 16 呋喃 呋喃妥因 Nitrofurantoin FT 300 ≤ 14 1516 ≥ 17 類 痢特靈 Furazolidone FR 300 ≤ 14 1516 ≥ 17 喹 萘啶酸 Naidixic Acid NA 30 ≤ 13 1418 ≥ 19 諾 諾氟沙星 Norfloxacin NOR 10 ≤ 12 1316 ≥ 17 酮 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin CIP 5 ≤ 15 1620 ≥ 21 類 氧氟沙星 Ofloxacin OFL 5 ≤ 12 1315 ≥ 16 碳青霉 亞胺配能 IMI 10 ≤ 13 1415 ≥ 16 烯類 Imipenem 細菌分離培養(yǎng)與鑒定程序 1. 基本要求 : 細菌 分離培養(yǎng)的全過程需在嚴格無菌的條件下進行。既要防止外界細菌污染病原菌 , 又要防止病原菌污染周圍環(huán)境。 2. 分離培養(yǎng) : 用無菌刀或剪切開病變部位，取其切面或用無菌棉拭取病料觸抹四種平板培養(yǎng)基 [營養(yǎng)瓊脂（ NA）、血液瓊脂（ BA)、麥康凱瓊脂（ Mac)、高鹽甘露醇瓊脂（ MSA)面，并用接種環(huán)劃線，放置在 37℃恒溫箱中培養(yǎng) 1824 小時。 在接種固體培養(yǎng)基的同時，接種四硫磺酸鈉亮綠增菌液（ TTB）（ VTTB:V 病料 ）=10:1)，置 37℃恒溫箱中培養(yǎng) 1824 小時，取 TTB培養(yǎng)物劃線接種 Mac平皿 ，置同樣條件下培養(yǎng)以分離沙門氏菌。 取平皿培養(yǎng)基上的菌落轉接于適宜培養(yǎng)基表面，置 37℃ 1824 小時做純培養(yǎng)，以便做進一步的檢查。 對于可疑厭氧菌或其它有特殊條件要求的細菌（如嗜血桿菌）感染的病料，要滿足相應的條件要求做病原的分離培養(yǎng)。 ： 在做病原的分離培養(yǎng)的同時，取病料涂片，做革蘭氏染色，和 /或瑞氏染色，和/或姬姆薩染色，用光學顯微鏡觀察細菌的形態(tài)特性。 取純培養(yǎng)物做上述同樣的染色，用同樣的方法觀察細菌的形態(tài)特性。如果病料中的細菌與純培養(yǎng)物的形態(tài)特性一致，可確定該 純培養(yǎng)為病料中的細菌。 觀察細菌在固體培養(yǎng)