【正文】 趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉，校正 PH 為 ，加入 1％硫柳汞，攪拌均勻，冷至 55℃－ 60℃，傾注平板。 10 磅壓力下滅菌 20 分鐘，待冷至 50－ 60℃時(shí)，傾注平板。 （ 2）制法：在燒杯內(nèi)裝入氯化鈉（ 1000ml 水中加入約 400 克氯化鈉）用水煮沸。 （ 3）制法： 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，根據(jù)需要分裝成瓶，分裝時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖，使其中的碳酸鈣混勻。培養(yǎng) 5天后觀察結(jié)果。每天照蛋，棄去接種后 24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，收獲死亡胚，標(biāo)記日期，存放于 4℃冰箱中。 疫苗的復(fù)蘇：按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。 病毒和分子生物 病毒室負(fù)責(zé)禽病毒活毒疫苗的毒價(jià)檢測(cè)。 加雞糞組： 除不向各試管中加入雞糞外，其余各項(xiàng)設(shè)置同加雞糞組。 傾注 :同水樣。 (2).若大小之比≥ 2,以小稀釋度的為準(zhǔn) ,例如 :10 10 103三個(gè)稀 釋度的菌落數(shù)為 27 6 4, 以 103為細(xì)菌總數(shù)。 :向水浴鍋內(nèi)加入純凈 水適量 ,溫度調(diào)至 55℃。 A: 產(chǎn)酸 。 : 登記、編號(hào) : 化驗(yàn)室接到樣品后，首先根據(jù)送檢單對(duì)其進(jìn)行清點(diǎn)和簦記。如菌體 彼此相凝集成明顯或較明顯的小顆粒狀物，即可 認(rèn)為有自凝性。 加樣 : 用 2 毫升吸管在浸有棉拭子的試管中反復(fù)吸打使之均勻，然后吸取 2 毫升稀釋液，分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的四個(gè)平皿內(nèi) ,每個(gè)平皿 毫升。 ： 在做病原的分離培養(yǎng)的同時(shí)，取病料涂片，做革蘭氏染色，和 /或瑞氏染色，和/或姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)特性。 4 用直尺測(cè)量藥敏紙片周圍的抑菌圈大小并記錄結(jié)果。 1 培養(yǎng)基：一般用 WHO 推薦的 MH 培養(yǎng)基。綜合上述各項(xiàng)檢查結(jié)果作出診斷并出具報(bào)告。 三．雞病診斷程序 1組織塊較大，放置于每種溶液中的時(shí)間要長些；反之，則短些。 5. 仰臥雞只，用手術(shù)剪從腹側(cè)正中剖開皮膚，檢查皮下組織、肌肉（包括雛雞的胸腺等）。 4．在每孔中加入 100ul兔抗 p27辣根過氧化物酶結(jié)合物。 10．重復(fù)第 6， 7兩步。 27．結(jié)果判定：血清 HI 抗體效價(jià) ? 80 的為陽性。 43． 用 12 頭移液器吸取上述 HA 試驗(yàn)中 4 單位病毒液，于每孔中各加入 毫升。 21． 用 12 頭移液器向每個(gè)孔中加入 %生理鹽水 毫升。然后作好標(biāo)記，準(zhǔn)備加樣品。 使用前 將抗原和血清從冰箱取出，待其溫度接近室溫時(shí)再做試驗(yàn)。一般在 20 秒鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)， 2 分鐘判定結(jié)果。 判定： 1．陽性：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原之間有明顯致密的沉淀線時(shí)，受檢也形成沉淀線或者陽性血清的沉淀線末端向毗鄰的受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎者，此判為陽性。 23．在微型震蕩器上震蕩，混勻約 12 分鐘，再靜置。 47． 結(jié)果判定：將反應(yīng)板豎立于桌上，沉于管底的紅細(xì)胞沿著斜面向下呈線狀流動(dòng)者，表示血清中含有足量能抑制病毒液凝集 紅細(xì)胞的抗體；若孔底的紅細(xì)胞呈現(xiàn)邊緣不齊的分散狀態(tài)，表示血清中的抗體量不足以完全抑制病毒凝集紅細(xì)胞的作用，或者表示血清中無特異性抗體。 1．取出已包被好抗體的酶標(biāo)板，作好標(biāo)記，并在 FlockCheck 工作表上作好加樣記錄。 15．在 650nm波長下測(cè)量并記錄標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔和樣品孔的光吸收值。 9．在每孔中加入 100ul終止液終止反應(yīng)。 10. 檢查全身骨、關(guān)節(jié)。 組織浸蠟：依次置于三種熔點(diǎn)不同的軟蠟中各 ，最后浸于硬蠟中。 3 稀釋液：用滅菌蒸餾水。封存于 20℃冰箱中保存（使用期限以藥敏紙片制造單位所附的有效期為準(zhǔn)）備用。 3， 2 結(jié)合臨床病變、細(xì)菌的染色特性、細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長特性、溶血性等，可初步鑒定細(xì)菌的種類。 取增菌液一環(huán)劃線接種于沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基 (SS)板上，然后將其置于 37℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)粉紅色菌落數(shù)，通過生化鑒定大腸桿菌；霉菌瓊脂培養(yǎng)基置于室溫下再經(jīng)過 24小時(shí)記數(shù)霉菌數(shù)。 加樣 : 用 2 毫升吸管在浸有棉拭子的試管中反復(fù)吸打使之均勻，然后吸取 2 毫升稀釋液，分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的四個(gè)平皿內(nèi) ,每個(gè)平皿 毫升。如菌體 彼此相凝集成明顯或較明顯的小顆粒狀物，即可認(rèn)為有自凝性。 ) 稀釋、加樣 : A:用試管架擺上多組試管，每組 3 支，每個(gè)水樣各占一組，每個(gè)試管內(nèi)加入 9 毫升滅菌鹽水。 : 培養(yǎng)基 : A:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (NA.)、 B:麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 (Mac.)、 C:高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基 (MSA.)、 D:霉菌瓊脂培養(yǎng)基 (MM.)、 E:沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基 ()、 F:四硫磺酸鈉增菌液 (TTB.)、 G:三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基、 H:賴氨酸鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基、 I:尿素及其它常見生化試驗(yàn)管、 I:沙門氏菌屬血清、 器械 (皿 ): A:剪子、鑷子、天平、酒精燈、火柴、酒精棉、記號(hào)筆、試管架、滅菌鹽水、液泵、塑料桶等。 :麥康凱瓊脂 (Mac)、高鹽甘露醇瓊脂 (MSA)、沙門氏志賀氏瓊脂 ()、營養(yǎng)瓊脂 (NA)、營養(yǎng)肉湯 (NB)。2ml 滅菌吸管 。 疫苗的復(fù)蘇：按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。打開所有雞胚，觀察 IBV 引起的特征性病變，計(jì)算每個(gè)稀釋度的累計(jì)感染胚數(shù)。用 ReedMuench法計(jì)算疫苗的毒價(jià) (EID50/Dose)。用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將疫苗再作 10 倍系列稀釋 (101至 109)。 緩沖蛋白胨水（ BP） （ 1）成分：蛋白胨 10 克，氯化鈉 5 克，磷酸氫二鈉 9 克（無水 克），磷酸二氫鉀 克；蒸餾水 1000ml。 （ 2）制法：先用開水 3700 毫升，將重酪酸鉀充分溶解，再緩緩的將硫酸倒入，邊倒邊攪勻，然后放入較為堅(jiān)固耐溶器內(nèi)。 本培養(yǎng)基均勻高壓滅菌或加熱時(shí)間過長。趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 1％硫柳汞 5ml，攪均后待冷至 60℃傾注平板，每板 20 毫升，厚為 3mm。 葡萄糖瓊脂 （ 1）成分：市售葡萄糖瓊脂 ，蒸餾水 100ml。 （ 2）制法：取滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100 毫升，加熱溶化，待冷至 50℃時(shí)，以無菌手續(xù)加入脫纖血 10 毫升，輕輕搖勻，傾注于滅菌平皿中，經(jīng)無菌檢查后，即可放入冰箱中保存?zhèn)溆谩? 磷酸鹽緩沖液（ PBS） （ 1）成分：氯化鈉 8 克，氯化鉀 克，磷酸二氫鉀 克，磷酸氫二鈉 克。 結(jié)果判定：計(jì)算每瓶的空斑數(shù)。 101及 102稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細(xì)胞做對(duì)照。測(cè)定程序如下： 按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。收獲尿囊液并做 HA 試驗(yàn)。 1ml 消毒液加入上述 4 塊平皿內(nèi)。 、匍萄球菌、沙門氏菌及綠膿桿菌的懸液 5ml,同時(shí)向各管中加入 10%雞糞 1 毫升 ,以消除實(shí)驗(yàn)誤差 ,因生 產(chǎn)實(shí) 踐中有機(jī)物對(duì)消毒效果有影響。 標(biāo)號(hào) :稀釋、加樣前先要將三角瓶上的編號(hào)標(biāo)記在平皿上 ,每份墊料使用 6 個(gè)平皿。營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)粉紅色菌落數(shù)，通過生化鑒定大腸桿菌 。不同的曲霉分生孢子的顏色不一樣 ,有黃、蘭、青、黑綠、棕等色；鐮孢酶的菌絲有隔 ,產(chǎn)生在菌絲孢子上的分生孢子 ,大分生孢子呈鐮刀狀 ,有的呈豆角狀。觀察其菌落形態(tài)是否有可疑沙門氏菌落 ,若有無色半透明 。霉菌瓊脂培養(yǎng)基置于室溫下再經(jīng)過 24 小時(shí)記數(shù)霉菌數(shù)；高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基也置于室溫下經(jīng)過 24 小時(shí)后觀察其菌落形態(tài)，對(duì)培養(yǎng)基上長出的圓形、光滑、隆起的菌落染色鏡檢鑒定葡萄球菌。 A: 產(chǎn)酸 。 : 登記、編號(hào) : 化驗(yàn)室接到樣品后，首先根據(jù)送檢單對(duì)其進(jìn)行清點(diǎn)和簦記。既要防止外界細(xì)菌污染病原菌 , 又要防止病原菌污染周圍環(huán)境。 2 按照藥敏試驗(yàn)檢驗(yàn)程序記錄結(jié)果，并判定試驗(yàn)微生物對(duì)受檢抗生素的敏感性。 6 石蠟切片的染色： 常用 蘇木素 伊紅染色法。如腦組織，要從腦正中垂直縱切后固定；消化道上皮等不定形的組織，要放在硬紙片上幫助定形后固定。 3. 處死病雞。另外，所有試劑在使用之前都應(yīng)回復(fù)到室溫，并且應(yīng)輕旋混勻。 6．將所有孔中的液體甩入一個(gè)廢液回收容器 內(nèi)。 22．用單頭移液器吸取待檢血清 加入第 1 孔中，反復(fù)擠壓稀釋 5 次，吸出 加入第 2 孔中，如此連續(xù)稀釋至第六孔，血清稀釋倍數(shù)依次為 1:101:320，最后從第六孔中吸出 棄去。 4．紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（ HI） 新城疫病毒凝集紅細(xì)胞的作用，能被特異性抗體抑制。 13． 被檢血清：由雞場(chǎng)送來的裝有全血的采血管，經(jīng) 10000 轉(zhuǎn) /分鐘，離心 5 分鐘，待血清析出后使用。瓊脂平板由供應(yīng)室制備。 保健中心檢驗(yàn)程序 血清學(xué) 一．血清平板凝集試驗(yàn) 細(xì)菌等顆粒性抗原的懸液與相應(yīng)的抗體結(jié)合后 ,在電解質(zhì)的參與下，抗原顆粒相互凝集形成團(tuán)塊 ,這種現(xiàn)象叫做凝集反應(yīng)。大體有三種，即： PBS， %PBS， BBS。如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細(xì)胞泥，按 1% 的稀釋度加入生理鹽水（ 1 毫升紅細(xì)胞泥加 99 毫升 % 的生理鹽水）。如上例，病毒液 HA 效價(jià)為 1:256，在 HI試驗(yàn)時(shí)，病毒抗原液 ml 內(nèi)須含 4 個(gè)凝集單位，則應(yīng)將病毒液 作成 256/4=64 倍的稀釋液。 2．紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（ HI） 21．用移液器向第 1 孔中加生理鹽水 ，第 2 孔至第 12 孔每孔加生理鹽水 。 5．在室溫下孵育 60 分鐘。使用時(shí)將濃洗液 1:20稀釋，如： 20ml 濃洗液加入 380ml水中，可用于一塊酶標(biāo)板的洗滌。 2. 用注射器采病雞血液（較大雞：從翅膀 靜脈采；較小雞：從心臟采）放在采血管中并編號(hào)。對(duì)于特殊組織要做特殊的處理。 將切片置于烤箱中烤干 (烤片溫度一般不超過 50℃，時(shí)間約 13小時(shí) )。檢查病變組織的病理組織學(xué)檢查結(jié)果。 用加樣器取 5微升混勻的待檢抗生素稀釋液加到培養(yǎng)基中的濾紙片上，待液體吸入濾紙片和培養(yǎng)基后，將平皿置于 37℃溫箱中培養(yǎng) 1618 小時(shí)。 1 在無菌條件下，取新鮮無污染的可疑含菌臨床病料或經(jīng)過純培養(yǎng)的致病菌均勻涂抹培養(yǎng)基表面。 附：《抗菌藥物藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)》 抗菌藥物 代 紙片 抑菌圈直徑 (mm) 類 名 號(hào) 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 別 稱 微克 /片 （ R） （ M） （ S） 氨基 慶大霉素 Gentamycin GM 10 ≤ 12 1314 ≥ 15 糖甙類 新霉素 Neomycin N 30 ≤ 12 1316 ≥ 17 青 氨芐青霉素 Ampicillin AM 10 霉 當(dāng)測(cè)試革蘭氏陰性腸內(nèi)細(xì)菌 ≤ 13 1416 ≥ 17 素 當(dāng)測(cè)試匍萄球菌 ≤ 28 ≥ 29 類 當(dāng)測(cè)試腸球菌 ≤ 16 17 及 奧格門丁 Amoxicillin/Clavulanic Acid AMX/CA 20/10 其 當(dāng)測(cè)試匍萄球菌屬 ≤ 19 ≥ 20 復(fù)合劑 當(dāng)測(cè)試其他細(xì)菌 ≤ 13 1417 ≥ 18 頭 頭孢唑啉 Cefazolin CZ 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 孢 頭孢三嗪 Ceftriaxone CRO 30 ≤ 13 1420 ≥ 21 類 頭孢噻吩 Cephalothin CF 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 頭孢美唑 Cefmetazole CME 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 四環(huán)素 四環(huán)素 Tetracycline TE 30 ≤ 14 1518 ≥ 19 類 強(qiáng)力霉素 Doxycycline DO 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 大環(huán) 紅霉素 Erythromycin E 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 內(nèi)酯類 柱晶白霉素 Leuycin LU 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 多 萬古霉素 Vanycin VA 30 肽 當(dāng)測(cè)試腸球菌 ≤ 14 1516 ≥ 17 類 當(dāng)測(cè)試革蘭氏陰