【正文】 Mac、 MSA、 MM 四種液體培養(yǎng)基分別傾注到四組平皿中，每種培養(yǎng)基傾注一組，每個(gè)平皿 15 毫升，傾注后搖勻冷卻。 :滅菌鹽水、液泵、記號筆、試管架、塑料桶等。如果病料中的細(xì)菌與純培養(yǎng)物的形態(tài)特性一致，可確定該 純培養(yǎng)為病料中的細(xì)菌。 附：《抗菌藥物藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)》 抗菌藥物 代 紙片 抑菌圈直徑 (mm) 類 名 號 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 別 稱 微克 /片 （ R） （ M） （ S） 氨基 慶大霉素 Gentamycin GM 10 ≤ 12 1314 ≥ 15 糖甙類 新霉素 Neomycin N 30 ≤ 12 1316 ≥ 17 青 氨芐青霉素 Ampicillin AM 10 霉 當(dāng)測試革蘭氏陰性腸內(nèi)細(xì)菌 ≤ 13 1416 ≥ 17 素 當(dāng)測試匍萄球菌 ≤ 28 ≥ 29 類 當(dāng)測試腸球菌 ≤ 16 17 及 奧格門丁 Amoxicillin/Clavulanic Acid AMX/CA 20/10 其 當(dāng)測試匍萄球菌屬 ≤ 19 ≥ 20 復(fù)合劑 當(dāng)測試其他細(xì)菌 ≤ 13 1417 ≥ 18 頭 頭孢唑啉 Cefazolin CZ 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 孢 頭孢三嗪 Ceftriaxone CRO 30 ≤ 13 1420 ≥ 21 類 頭孢噻吩 Cephalothin CF 30 ≤ 14 1517 ≥ 18 頭孢美唑 Cefmetazole CME 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 四環(huán)素 四環(huán)素 Tetracycline TE 30 ≤ 14 1518 ≥ 19 類 強(qiáng)力霉素 Doxycycline DO 30 ≤ 12 1315 ≥ 16 大環(huán) 紅霉素 Erythromycin E 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 內(nèi)酯類 柱晶白霉素 Leuycin LU 15 ≤ 13 1422 ≥ 23 多 萬古霉素 Vanycin VA 30 肽 當(dāng)測試腸球菌 ≤ 14 1516 ≥ 17 類 當(dāng)測試革蘭氏陰性細(xì)菌 ≤ 9 1011 ≥ 12 磺 磺胺甲基異惡唑 Sulfamethoxazole SMX 300 ≤ 12 1316 ≥ 17 胺 類 復(fù)方新諾明 Sulfamethoxazole/Trimethoprim SXT ≤ 10 1115 ≥ 16 呋喃 呋喃妥因 Nitrofurantoin FT 300 ≤ 14 1516 ≥ 17 類 痢特靈 Furazolidone FR 300 ≤ 14 1516 ≥ 17 喹 萘啶酸 Naidixic Acid NA 30 ≤ 13 1418 ≥ 19 諾 諾氟沙星 Norfloxacin NOR 10 ≤ 12 1316 ≥ 17 酮 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin CIP 5 ≤ 15 1620 ≥ 21 類 氧氟沙星 Ofloxacin OFL 5 ≤ 12 1315 ≥ 16 碳青霉 亞胺配能 IMI 10 ≤ 13 1415 ≥ 16 烯類 Imipenem 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定程序 1. 基本要求 : 細(xì)菌 分離培養(yǎng)的全過程需在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行。 5 如果在記錄結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿上沒有細(xì)菌菌落生長，或者細(xì)菌菌落生長不均勻，或者發(fā)現(xiàn)所有藥敏紙片的周圍沒有抑菌圈，則必需取經(jīng)過純培養(yǎng)的致病菌，重復(fù)上述 2 1 在無菌條件下，取新鮮無污染的可疑含菌臨床病料或經(jīng)過純培養(yǎng)的致病菌均勻涂抹培養(yǎng)基表面。密封于塑料袋中，放 48℃的冰箱中保存（不超過 7 天）備用。 用加樣器取 5微升混勻的待檢抗生素稀釋液加到培養(yǎng)基中的濾紙片上，待液體吸入濾紙片和培養(yǎng)基后，將平皿置于 37℃溫箱中培養(yǎng) 1618 小時(shí)。 試驗(yàn)微生物：選擇診斷室保存的對待檢抗生素 (或其同類抗生素 )敏感的致病微生物株作為試驗(yàn)微生物。檢查病變組織的病理組織學(xué)檢查結(jié)果。 2 將切片置于烤箱中烤干 (烤片溫度一般不超過 50℃，時(shí)間約 13小時(shí) )。 組織透明：用二甲苯透明。對于特殊組織要做特殊的處理。 7. 用解剖刀切開胸肌，檢查深層胸肌及注射油苗情況。 2. 用注射器采病雞血液（較大雞：從翅膀 靜脈采；較小雞：從心臟采）放在采血管中并編號。 6．重復(fù)第 3步。使用時(shí)將濃洗液 1:20稀釋，如： 20ml 濃洗液加入 380ml水中，可用于一塊酶標(biāo)板的洗滌。 12．在室溫下孵育顯色 15 分鐘。 5．在室溫下孵育 60 分鐘。 （五） 傳染性支氣管炎（ IB）的 HA 和 HI 試驗(yàn) 操作步驟及用量同于雞新城疫的 HA 和 HI 試驗(yàn)，只是在試驗(yàn)中所用的紅細(xì)胞懸液的濃度為 %。 2．紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（ HI） 21．用移液器向第 1 孔中加生理鹽水 ，第 2 孔至第 12 孔每孔加生理鹽水 。 45． 用 12 頭移液器吸取 1%紅細(xì)胞懸浮液，各孔加入中 毫升。如上例，病毒液 HA 效價(jià)為 1:256，在 HI試驗(yàn)時(shí)，病毒抗原液 ml 內(nèi)須含 4 個(gè)凝集單位，則應(yīng)將病毒液 作成 256/4=64 倍的稀釋液。第 12 孔做紅細(xì)胞對照孔。如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細(xì)胞泥，按 1% 的稀釋度加入生理鹽水（ 1 毫升紅細(xì)胞泥加 99 毫升 % 的生理鹽水）。 6 孔各加入待檢血清（抗原和待檢血清各孔加約 30 微升，每加一份血清更換一個(gè)滴頭。大體有三種，即： PBS， %PBS， BBS。并檢測一下抗原是否有自凝現(xiàn)象，如抗原污染細(xì)菌或霉菌，出現(xiàn)自凝顆?；蛎箞F(tuán)時(shí)應(yīng)廢棄。 保健中心檢驗(yàn)程序 血清學(xué) 一．血清平板凝集試驗(yàn) 細(xì)菌等顆粒性抗原的懸液與相應(yīng)的抗體結(jié)合后 ,在電解質(zhì)的參與下，抗原顆粒相互凝集形成團(tuán)塊 ,這種現(xiàn)象叫做凝集反應(yīng)。如抗原一次使用不完，剩余部分應(yīng)放回冰箱保存。瓊脂平板由供應(yīng)室制備。）加至孔滿為止，但不要溢出。 13． 被檢血清：由雞場送來的裝有全血的采血管，經(jīng) 10000 轉(zhuǎn) /分鐘，離心 5 分鐘，待血清析出后使用。每次至少重復(fù)測 4 排病毒液，以消除偶然誤差。 4．紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（ HI） 新城疫病毒凝集紅細(xì)胞的作用，能被特異性抗體抑制。 46． 置于震蕩器上震蕩混勻 12 分鐘，在 1822℃室溫下作用 40 分鐘后觀察結(jié)果。 22．用單頭移液器吸取待檢血清 加入第 1 孔中，反復(fù)擠壓稀釋 5 次，吸出 加入第 2 孔中，如此連續(xù)稀釋至第六孔，血清稀釋倍數(shù)依次為 1:101:320，最后從第六孔中吸出 棄去。 （六） 檢測血清的禽淋巴白血病 ELISA實(shí)驗(yàn)程序 準(zhǔn)備：所有試劑在使用之前都應(yīng)回復(fù)到室溫。 6．將所有孔中的液體甩入一個(gè)廢液回收容器 內(nèi)。 13．在每孔中加入 100ul終止液終止反應(yīng)。另外，所有試劑在使用之前都應(yīng)回復(fù)到室溫，并且應(yīng)輕旋混勻。 7．在每孔中加入 100ul TMB底物溶液。 3. 處死病雞。 8. 用解剖剪從龍骨左側(cè)打開胸腹腔，依次檢查 肝臟、心臟、氣囊、脾臟、性腺、腎臟、胃腸道及其內(nèi)容物、法氏囊和胸腹腔璧等。如腦組織，要從腦正中垂直縱切后固定；消化道上皮等不定形的組織，要放在硬紙片上幫助定形后固定。透明時(shí)間視組織塊大小和實(shí)際透明情況而定，一般不超過 1小時(shí)。 石蠟切片的染色： 常用 蘇木素 伊紅染色法。詳細(xì)檢查北京家禽育種有限公司保健中心病例背景登記表中的各項(xiàng)內(nèi)容，了解有關(guān)信息。 6一般選擇大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌四種常見致病菌作為試驗(yàn)微生物。 按照藥敏試驗(yàn)檢驗(yàn)程序記錄結(jié)果，并判定試驗(yàn)微生物對受檢抗生素的敏感性。 1 2 1， 2既要防止外界細(xì)菌污染病原菌 , 又要防止病原菌污染周圍環(huán)境。 觀察細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長特性及菌落形態(tài)特性。 : 登記、編號 : 化驗(yàn)室接到樣品后，首先根據(jù)送檢單對其進(jìn)行清點(diǎn)和簦記。 培養(yǎng) :待凝固后倒置于 37℃恒溫箱中培養(yǎng)。 A: 產(chǎn)酸 。 如為陽性結(jié)果以單“ O”血清進(jìn)一步進(jìn)行分群試驗(yàn)。霉菌瓊脂培養(yǎng)基置于室溫下再經(jīng)過 24 小時(shí)記數(shù)霉菌數(shù)；高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基也置于室溫下經(jīng)過 24 小時(shí)后觀察其菌落形態(tài)，對培養(yǎng)基上長出的圓形、光滑、隆起的菌落染色鏡檢鑒定葡萄球菌。 稀釋 : 在無菌室內(nèi)將全部試管蓋兒打開 ,每管內(nèi)加入 4 毫升滅菌鹽水 ,浸泡 510 分鐘。觀察其菌落形態(tài)是否有可疑沙門氏菌落 ,若有無色半透明 。 生化試驗(yàn)結(jié)果符合表 3 沙門氏菌特性的按 進(jìn)行。不同的曲霉分生孢子的顏色不一樣 ,有黃、蘭、青、黑綠、棕等色；鐮孢酶的菌絲有隔 ,產(chǎn)生在菌絲孢子上的分生孢子 ,大分生孢子呈鐮刀狀 ,有的呈豆角狀。 標(biāo)號 :稀釋、加樣前先將水瓶上的編號標(biāo)記在平皿底上 ,每個(gè)水樣使用 6 個(gè)平皿。營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)粉紅色菌落數(shù)，通過生化鑒定大腸桿菌 。 ：工作間籠頭、水箱、送水管、飲水器（或乳頭飲水器）等各部位選點(diǎn)，檢驗(yàn)程序同孵化場水樣。 標(biāo)號 :稀釋、加樣前先要將三角瓶上的編號標(biāo)記在平皿上 ,每份墊料使用 6 個(gè)平皿。 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) : 總菌數(shù) 105 總菌數(shù) 108 新 大腸桿菌 0 舊 墊 葡萄球菌 0 墊 料 沙門氏菌 0 料 沙門氏菌 0 綠膿 桿菌 0 霉菌 103 三 . 消毒劑及其使用效果的測定 1. 消毒劑殺菌效果測定（質(zhì)檢） 試驗(yàn)材料 : :由廠家提供或從市場購入。 、匍萄球菌、沙門氏菌及綠膿桿菌的懸液 5ml,同時(shí)向各管中加入 10%雞糞 1 毫升 ,以消除實(shí)驗(yàn)誤差 ,因生 產(chǎn)實(shí) 踐中有機(jī)物對消毒效果有影響。 : :250ml 滅菌采水瓶 。 1ml 消毒液加入上述 4 塊平皿內(nèi)。具體檢測方法如下。收獲尿囊液并做 HA 試驗(yàn)。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天 ,每天照蛋 ,棄去接種后 24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚 ,收獲死亡胚 ,標(biāo)記日期 ,存放于 4℃冰箱中。測定程序如下： 按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。打開所有雞胚 ,觀察 IBV 引起的特征性病變。 101及 102稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細(xì)胞做對照。作出疫苗檢測報(bào)告。 結(jié)果判定：計(jì)算每瓶的空斑數(shù)。 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 （ 1）成分：營養(yǎng)肉湯（市面有售）。 磷酸鹽緩沖液（ PBS） （ 1）成分：氯化鈉 8 克，氯化鉀 克，磷酸二氫鉀 克，磷酸氫二鈉 克。 （ 2） 制法：先用 1 公斤水熱水，將重酪酸鉀溶解后，然后放入溫水 19 公斤即可。 （ 2）制法：取滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100 毫升，加熱溶化，待冷至 50℃時(shí)，以無菌手續(xù)加入脫纖血 10 毫升，輕輕搖勻，傾注于滅菌平皿中，經(jīng)無菌檢查后，即可放入冰箱中保存?zhèn)溆谩＠鋮s到 60℃左右即可傾入平板凝固后，保存于冰箱備用。 葡萄糖瓊脂 （ 1）成分：市售葡萄糖瓊脂 ，蒸餾水 100ml。 PH 為 。趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 1％硫柳汞 5ml，攪均后待冷至 60℃傾注平板，每板 20 毫升，厚為 3mm。 磷酸鹽瓊擴(kuò)板 (PH=) （ 1）成分：磷酸氫二鈉 克（有水 克），磷酸二氫鉀 克，瓊脂 克，氯化鈉 40 克， 1％硫柳汞 5ml。 本培養(yǎng)基均勻高壓滅菌或加熱時(shí)間過長。此外加入血液后，要輕輕搖勻，防止產(chǎn)生氣泡。 （ 2）制法：先用開水 3700 毫升，將重酪酸鉀充分溶解，再緩緩的將硫酸倒入，邊倒邊攪勻，然后放入較為堅(jiān)固耐溶器內(nèi)。 保存 液 （ 1）成分：葡萄糖 克，檸檬酸鈉 克，檸檬酸 克，氯化鈉 克，蒸餾水1000 毫升。 緩沖蛋白胨水（ BP） （ 1）成分：蛋白胨 10 克，氯化鈉 5 克，磷酸氫二鈉 9 克（無水 克），磷酸二氫鉀 克；蒸餾水 1000ml。作出疫苗檢測報(bào)告。用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將疫苗再作 10 倍系列稀釋 (101至 109)。傾去病毒液