核酸提取及常見問題分析-文庫吧
2025-07-04 20:16 本頁面
【正文】 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 基因組 DNA－其它方法 ? 物理方式 ：玻璃珠法、 超聲波法、研磨法、凍融法 ? 化學(xué)方式 ：異硫氰酸胍法、堿裂解法 ? 生物方式 ：酶法 ? 根據(jù)細胞裂解方式的不同有： 基因組 DNA－其它方法 ? 吸附材料結(jié)合法： ? 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： ? 硅質(zhì)材料 ? 陰離子交換樹脂 ? 磁珠 高鹽低 pH值結(jié)合核酸，低鹽高 pH值洗脫。 快捷高效。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 適用于純度要求高的實驗。 磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。 基因組 DNA－其它方法 ? 濃鹽法 ： ? 有機溶劑抽提法： ? 密度梯度離心法： 利用 RNP和 DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離 有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用 利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)用堿處理 DNA溶液時，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在回到中性 pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 細胞器 DNA－差速離心法 ? 差速離心法原理 ? 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 ? 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。 線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的 比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 DNA提取的基本步驟 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) 材料準(zhǔn)備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 ? 提取血液基因組 DNA時，要選擇有核細胞（白細胞） ? 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） ? 培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒
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