【正文】 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。 ? 洗滌： 70％乙醇。 細(xì)胞器 DNA－差速離心法 ? 差速離心法原理 ? 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 ? 該復(fù)合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。可以先將材料貯存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－ 70℃ 或－ 20℃ 保存 ? 如要多次提取，請分成多份保存 ? 液氮長期保存，－ 70℃ 短期保存 提取的因素影響 RNA提取的因素 ? 樣品破碎及裂解 ： ? 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： ? 培養(yǎng)細(xì)胞： 通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀? ? 酵母和細(xì)菌： 一般 TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁 ? 動植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機(jī)相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 提取的通用方法? 異硫氰酸胍 /苯酚法 ? 步驟 : ? 材料準(zhǔn)備： 盡量新鮮。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 快捷高效。 對 策 原因 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 RNA提取的通用方法 ? 異硫氰酸胍 /苯酚法 ? 原理： ? 細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； ? 釋放出來的 DNA和 RNA由于在特定 pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離； ? 有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈 RNA。 樣品要相對小一點； ? 先用液氮研磨 ， 再加裂解液勻漿； ? 樣品與裂解液充分接觸前避免融化 ， 研磨用具必須預(yù)冷 ， 碾磨過程中及時補充液氮 。 ? 變性電泳條帶變淡： ? EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； ? 甲醛的質(zhì)量不高 。期間動作快速，樣品保持冷凍 ? 樣品量適當(dāng)，保證充分裂解 ? 為減少 DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量 提取的因素? 純化： ? 在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速； ? 經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時間長，易造成 RNA 降解； ? 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。 ? 用 PEG8000代替乙醇沉淀 DNA：在 500μ L DNA液中加入200μ l 20% PEG8000 (含 M NaCl) ，冰浴 20min。 注： CTAB溶液在低于 15℃ 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于 15℃ 。 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時，線狀染色體 DNA容易發(fā)生