核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析(存儲(chǔ)版)
【正文】 RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級(jí)結(jié)構(gòu) 將 RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度 反轉(zhuǎn)錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過(guò) 1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 可能原因 解決方案 RT常見(jiàn)問(wèn)題分析和解決方案 問(wèn)題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設(shè)計(jì)較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應(yīng)的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴(kuò)增級(jí) DNaseⅠ 處理 RNA 設(shè)計(jì)在 339。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 影響 RNA提取的因素 第一部分： DNA提取方法簡(jiǎn)介 第二部分： DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、 原因分析及其對(duì)策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡(jiǎn)介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見(jiàn) 問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策 RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細(xì)胞或組織： ? 裂解液的質(zhì)量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 。苯酚 /氯仿可抽提去除雜物。 核酸分離、純化 ?多酚的去除： ? 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： β 巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 ? 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如 PVP、 PEG(聚乙二醇 )，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與 DNA的結(jié)合 核酸分離、純化 ?鹽離子的去除： ? 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解 ? 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 ? 沉淀時(shí)加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀 ? 沉淀后應(yīng)用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 ? 晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥） ? 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用 TE緩沖液溶解 ? TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase ? pH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) 2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 3. DNA中殘留有金屬離子 1. 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前） 2. 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3. 增加 70％乙醇洗滌的次數(shù)（ 23次） DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題一： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對(duì)數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋
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