核酸提取及常見問題分析-wenkub
2022-08-16 20:16:43 本頁面
【正文】 ） 提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ? EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； ? NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使 DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； ? β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB PVP40 β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（ V/V）使用前加入 ? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少 DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對(duì)數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對(duì)策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對(duì)策 DNA提取的基本步驟 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) 材料準(zhǔn)備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 ? 提取血液基因組 DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） ? 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會(huì)造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） ? 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解 ? 材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致 DNA量少，純度低 ? 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： ? 植物材料－－液氮研磨 ? 動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨 ? 組培細(xì)胞－－蛋白酶 K ? 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠 ? 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 菌體量適當(dāng) ? 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮 ? 變性的時(shí)間不要過長（ 5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 ? 復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組 DNA的污染 ? G＋ 菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 核酸分離、純化 ? 采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 ? 采用有機(jī)（酚 /氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 ? 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 ? 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚 /氯仿抽提 ? 使用變性劑變性（ S
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