核酸提取及常見問題分析(更新版)
【正文】 OD 時(shí) ， 對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用 10 mM Tris， pH 。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機(jī)相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠 ?？梢韵葘⒉牧腺A存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－ 70℃ 或－ 20℃ 保存 ? 如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存 ? 液氮長(zhǎng)期保存，－ 70℃ 短期保存 提取的因素影響 RNA提取的因素 ? 樣品破碎及裂解 ： ? 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： ? 培養(yǎng)細(xì)胞： 通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀? ? 酵母和細(xì)菌： 一般 TRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁 ? 動(dòng)植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放 RNA，有效抑制核酸酶。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。 ? 該復(fù)合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ CTAB法 ? SDS法原理 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS是一種陰離子去垢劑 ， 在高溫 （ 55～ 65℃ ） 條件下能裂解細(xì)胞 ， 使染色體離析 ， 蛋白變性 ， 釋放出核酸； ? 提高鹽 (KAc或 NH4Ac)濃度并降低溫度 （ 冰浴 ） ， 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 ， 離心后除去沉淀； ? 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提 ， 反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 細(xì)胞器 DNA－差速離心法 ? 差速離心法原理 ? 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 原因 對(duì) 策 1. 材料不新鮮或反復(fù)凍融 2. 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 3. 提取過程操作過于劇烈， DNA被機(jī)械打斷 4. 外源核酸酶污染 5. 反復(fù)凍融 1. 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融 2. 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液 3. 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的 DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量 4. 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 5. 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 6. 將 DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融 DNA提取常見問題 ?問題二： DNA降解。 ? 洗滌： 70％乙醇。 建議在液氮條件下將組織碾碎 ， 并且勻漿時(shí)使用更多裂解液 。 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。端沒有互補(bǔ)序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題三： 產(chǎn)生彌散（ smear）條帶 ? 第一鏈產(chǎn)物的含量過高 ? PCR反應(yīng)中引物過多 ? 循環(huán)數(shù)過多 ? 退火溫度過低 ? 寡核苷酸片段產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增 常規(guī) PCR步驟中減少第一鏈產(chǎn)物的量 減少引物的用量 減少 PCR的循環(huán)次數(shù) 提高退火溫度 提取高質(zhì)量 RNA，防止被 DNA污染 可能原因 解決方案 謝謝！ 北京天為時(shí)代科技有限公司 // 本公司產(chǎn)品江蘇地區(qū)特約代理商 南京天為生物科技有限公司 聯(lián)系電話： 02586073713 84705301 84701501 24小時(shí)訂貨熱線： 13057585177 聯(lián)系人：王彤 免費(fèi)技術(shù)支持： 800 810 2177
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