《雙向凝膠電泳》ppt課件 (2)-文庫吧
2025-04-18 18:46 本頁面
【正文】 離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ， 再用 pH梯度小于 2個(gè)pH單位的 IPG膠進(jìn)行窄 pH范圍的分離 。 ?強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體 ）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊 pH梯度的 IPG膠條（如 pH3－ 1412或 1012）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性 IPG膠（如 pH1012）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性 IPG膠（如pH31 412）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。 ?極端分子量的蛋白質(zhì)：小于 8kD和大于 200kD的蛋白在常規(guī) IPG2D上不易看到，這可能是在 Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的 dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。 一維固相 pH梯度等電聚焦（ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CHCONHR結(jié)構(gòu)的 8種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在 pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的 IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 Immobilized pH Gradient (IPG) IPG膠條的重泡脹 ? 泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的 IEF 常用的泡脹液的成分為 8M尿素， 2％的去污劑（ NP40,Triton X100,CHAPS),15mM DTT,% IPG buffer 蛋白載樣量 影響 IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括： ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。 ? 待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。 ? 不同的加樣方法和加樣量（根據(jù)顯色方法） ? 待研究蛋白的豐度 ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。 ? IPG膠條的 pH范圍 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。 ?溫度的選擇 ： 20176。 (防止低溫尿素結(jié)晶） IPG IEF 中的溫度 聚焦時(shí)間 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是 IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。 ? 聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 ? 過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 ? 最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、 pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。 IEF的基本條件 Step 1 Step 2 Step 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Step 1 Step 2 Step 3 total total Step 1 Step 2 Step 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid Protean IE
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