【正文】 補(bǔ)上數(shù)據(jù)： （ ） 其中 Cf為插入時(shí)間點(diǎn) tf的相應(yīng)濃度 ， C1和 C2分別表示插入時(shí)間點(diǎn) tf前面的時(shí)間點(diǎn) （ t1） 和 tf后面的時(shí)間點(diǎn) （ t2） 的濃度 。 )( 112121 ttttCCCCff ?????采樣量：在藥物動(dòng)力學(xué)研究中，原則上是采血樣的量是愈少愈好。因?yàn)樗幬飫?dòng)力學(xué)是研究藥物在機(jī)體內(nèi)吸收，分布，代謝和排泄的規(guī)律的一門科學(xué)，所采血樣的多少自然會(huì)影響藥物在體內(nèi)過程的量的變化。實(shí)際中，可根據(jù)檢測(cè)方法的靈敏度確定所需樣品的量。每次采血量以能夠滿足 3次重復(fù)測(cè)定所需量為度。實(shí)測(cè)兩次，求取平均值，留一份備用。 采樣量對(duì)于大動(dòng)物來說（例如每次采集 5ml血液）影響相對(duì)較小。但對(duì)于小動(dòng)物來說，采血量的多少就必須嚴(yán)格控制。從生理學(xué)角度分析，動(dòng)物血液量占體重平均為 57%左右。即體重為 1kg的動(dòng)物的全血量約為 5070ml。 所以，對(duì)于一個(gè)體重為 1kg2kg的家禽來講，每次采血量如果超過，一次藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)完成后，試驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體血液會(huì)減少超過總血量 5%以上。 因此對(duì)于禽類的采血量每次應(yīng)控制在 。否則，應(yīng)提高檢測(cè)方法的靈敏度，以降低采血量。 樣品的處理及保存： 血樣包括全血 、 血漿和血清三種形式 。 血漿通常是添加肝素 ，經(jīng)離心 （ 1500r/min） 30分鐘分離得到 。 無論是全血 、 血漿和血清樣品在制取時(shí)均應(yīng)避免溶血反應(yīng) 。 樣品得到后應(yīng)立即處理測(cè)定 ， 如不能立即測(cè)定 ， 應(yīng)置于 20℃ 以下冰箱中保存 。 對(duì)于激素類或易發(fā)生生物降解的藥物 ， 盡可能及時(shí)測(cè)定 。 值得說明的是 ， 血漿 （ Plasma） 是通過加抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取上層的清液 。 抗凝劑通常有肝素 ， 草酸鹽 、 枸櫞酸鈉等 ， 但最好選用肝素 ， 因?yàn)楦嗡乇旧硎茄褐械某煞?， 其抗凝效果好 ， 用量低 ， 不會(huì)干擾血藥濃度的測(cè)定 。 如確認(rèn)對(duì)待測(cè)藥品的測(cè)定無影響 ， 也可選用其他抗凝劑 。 抗凝劑的用法與用量： 肝素：常用其鈉鹽 ， 每 1ml血液加肝素約 （ 注： 1mg肝素相當(dāng)120130國際單位 ） ， 防止血液凝固 。 草酸鉀：由于其毒性作用不得作為體內(nèi)抗凝劑 。 為體外生化檢驗(yàn)的抗凝劑 。 每 1ml血液加草酸鉀 2mg。 由于量太少 ， 使用時(shí) ， 可將草酸鉀配成 10%水溶液 ， 按抗凝劑量加于采血管中 ， 在 50℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)干燥備用 。 10%的草酸鉀 5ml血液 。 值得注意的是草酸根具有較強(qiáng)的還原性 ， 易受氧化還原影響的藥物不得用本品抗凝 。 另外草酸鉀對(duì)血液中酶如乳酸脫氫酶 、 酸性磷酸酶 、 淀粉酶有抑制作用 。 枸櫞酸鈉：每 1ml血液加枸櫞酸鈉 ， 使用時(shí)與草酸鉀一樣 ， 將枸櫞酸鈉配成 25%的水溶液 ， 按抗凝劑量加于采血管中 ，在 45℃ 溫度條件下干燥備用 。 25%的枸櫞酸鈉 1ml血液 。 乙二胺四乙酸 （ EDTA） ：常用其二鈉鹽 （ EDTANa2） ：每 ml血液加本品 。 本品化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有 N和 Na元素 ， 不適宜于含氮化合物和鈉的測(cè)定 。 由于藥物在血液中分布可能不均勻，所以無論是全血、血漿還是血液，制備時(shí)都必須防止發(fā)生溶血。對(duì)于血漿和血清，發(fā)生溶血時(shí)還會(huì)增加藥物定量分析的干擾成分。 在實(shí)踐中防止溶血應(yīng)該做到：采血針頭與試管必須干燥潔凈；抗凝劑應(yīng)按量添加到采血管中，并在干燥后使用；采血時(shí)注意輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管讓血液與抗凝劑混合，不得用力振搖；分離血漿或血清時(shí)，離心速度不得過快，以 1500r/min轉(zhuǎn)速即可。 制備血清時(shí) ， 防止過早撥動(dòng)血塊；寒冷會(huì)使紅細(xì)胞脆性增大 ，制備血清時(shí) ， 應(yīng)將血液放入 37℃ 培養(yǎng)箱預(yù)熱 30分鐘后 ， 用針頭從管壁剝離 ， 并繼續(xù)保溫使血清析出 。 如不能很快檢驗(yàn) ， 抗凝血應(yīng)放在 4℃ 冰箱保存 。 血漿和血清應(yīng)放在 20℃ 條件下保存 。 尿藥的測(cè)定可用于藥物劑量的回收、藥物腎清除率及代謝物類型的研究。同時(shí)也可用于藥物乙?；x（如磺胺類藥物）和氧化代謝多態(tài)性（如喹噁啉類藥物）等的研究。測(cè)定尿藥濃度比測(cè)定血藥濃度相對(duì)來說要麻煩。因?yàn)槟蛞核幬餄舛茸兓^大，要反映藥物在體內(nèi)的代謝排泄過程，必須定時(shí)收集一定時(shí)間內(nèi)的尿液，并對(duì)整個(gè)的排尿量要進(jìn)行確定。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)，既要測(cè)定尿液的體積（排尿量），又要測(cè)定其中藥物或代謝物的含量。 尿液的主要成分是水 、 尿素 （ 禽類為尿酸 ） 及鹽類 ，比較適合于細(xì)菌繁殖與生長(zhǎng) ， 所以最好在收集到尿樣后立即進(jìn)行測(cè)定 。 若需收集 24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間的尿液或不能立即測(cè)定時(shí) ， 則將尿液置于 4℃ 冰箱保存 。 若在室溫下保存 ，應(yīng)在采樣后立即加入對(duì)藥品及其代謝物測(cè)定無干擾的防腐劑 。 放置時(shí)間較長(zhǎng)則需要冷凍貯存 。 血樣中的抗凝全血通常只能在 4℃ 冰箱保存 ， 溫度過低自然會(huì)引起因解凍而發(fā)生溶血 。 而血清 、 血漿和尿樣及其他組織樣不能立即測(cè)定時(shí)則必須進(jìn)行冷凍貯存 ， 冷凍溫度一般在 20℃ 以下 。理想的冷凍溫度范圍為 40℃ 80℃ 。 常用冷凍劑的配方有 : ⑴ NaCl: 冰塊 （ 33:100） ， 最低冷凍溫度為 21℃ ； ⑵ NH4Cl：冰塊 （ 25:100） ， 最低冷凍溫度為 15℃ ； ⑶ CaCl 6H2O：冰塊 （ 20:100） ， 最低冷凍溫度為 4℃ ； ⑷ NH4Cl： NaCl: 冰塊 （ 20:40:100） ， 最低冷凍溫度為 30℃ ； ⑸ 氯仿 +固體 CO2， 最低冷凍溫度為 77℃ ⑹ 酒精 +固體 CO2， 最低冷凍溫度為 72℃ 冷凍樣品測(cè)定時(shí) ， 要求解凍后樣品一次性測(cè)定完畢 。 不得將解凍樣品再進(jìn)行冷凍貯存后再解凍測(cè)定 。 因?yàn)闃悠吩诮鈨雠c冷凍反復(fù)循環(huán)過程中 ， 樣品中的待測(cè)藥物含量會(huì)發(fā)生明顯降解現(xiàn)象 。 反復(fù)冷凍的生物組織特別是細(xì)胞也會(huì)發(fā)生變性 、 壞死現(xiàn)象 。 （ 五 ） 樣品的預(yù)處理及測(cè)定 樣品的處理：體液中的藥物由于體液中雜質(zhì)的干擾通常不能用儀器直接進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定之前必須將體液中的藥物提取。這一過程稱為樣品測(cè)定前處理，即樣品的處理。藥物動(dòng)力學(xué)研究中，通常是要測(cè)定體液中藥物的含量，且藥物濃度較低，絕大部分達(dá)到微量水平。 因此，在定量測(cè)定前，要對(duì)生物體液或組織中的待測(cè)成分進(jìn)行分離和富集來提高分析測(cè)定的靈敏度。通過分離，可以把干擾組分分開，以提高檢測(cè)方法的專一性。富集是指從大量基體物質(zhì)（生物體液或組織成分）中將待測(cè)量的組分集中到一較小體積溶液中，以提高檢測(cè)的靈敏度，因此生物組織中藥物測(cè)定的預(yù)處理關(guān)系到定量分析的專一性與靈敏度，是藥物分析的關(guān)鍵性步驟。 在定量分析中 ， 存在著如下幾種情況時(shí) ， 則必須對(duì)樣品首先進(jìn)行分離富集預(yù)處理：樣品中存在干擾物質(zhì)；樣品的物理 、化學(xué)狀態(tài)不適于直接進(jìn)行測(cè)定；沒有合適的標(biāo)準(zhǔn)參照物；待測(cè)藥物或代謝物在樣品中分布不均勻；待測(cè)藥物的含量極低 ， 低于現(xiàn)有檢測(cè)方法的檢測(cè)限 。 在定量分析中常用的分離方法包括：根據(jù)分子大小與幾何形狀或電荷進(jìn)行分離的分子篩、凝膠滲透色譜、氣體擴(kuò)散，膜滲析、電泳等分析；根據(jù)表面活性進(jìn)行分離的吸附色譜，高效液相色譜、活性碳吸附方法；根據(jù)藥物的揮發(fā)性進(jìn)行分離的蒸餾與揮發(fā)、升華、冷凍干燥，有機(jī)物灰化方法； 根據(jù)溶解度進(jìn)行分離的沉淀 、 共沉淀 、 選擇溶解方法；根據(jù)分配平衡進(jìn)行分離的溶劑萃取法 ， 固液萃取法 、 分配色譜法 、薄層色譜法以及根據(jù)離子交換平衡進(jìn)行測(cè)定的無機(jī)和有機(jī)離子交換法等 。 其中在藥物分析中樣品的預(yù)處理常用的是沉淀法 、 和溶劑萃取法 。 (1)樣品分離回收率 在樣品預(yù)處理時(shí) ， 通常用回收率 （ R） 來對(duì)其分離方效果進(jìn)行評(píng)價(jià) ， 其回收率定義如下： () 其中 ， 和 分別代表富集后和富集前待測(cè)藥物的量 。 0TQ%100/ 0 ?? TT RTQ 由于在分離和富集過程中 ， 由于揮發(fā) 、 分解或分離不完全 ，處理器具的吸附作用以及其他人為因素可能造成部分組分丟失 ，所以其回收率通常小于 100%。 在分析測(cè)定時(shí) ， 回收率越高 ， 其分析方法結(jié)果的可靠性就越高 。 一般定量分析要求其回收率達(dá)到 80%以上 。 值得說明的是 ， 有時(shí)由于分離技術(shù)條件的限制 ， 造成回收率較低 （ 50%左右 ） ， 但如果分離的穩(wěn)定性 （ 重復(fù)性 ） 較好 ， 在分析中也是允許的 。 在藥品定量分析中應(yīng)盡可能提高其樣品處理的回收率 。主要注意如下幾方面的問題：選擇恰當(dāng)?shù)姆蛛x方法；選擇最佳的萃取溶劑；在低溫條件下萃取 （ 例如通氮?dú)獾?） ， 防止藥物的氧化分解；增加萃取的次數(shù)等 。 （ 2） 干擾組分的消除 血藥濃度的測(cè)定中 ， 干擾組分通常包括血漿蛋白質(zhì)及其脂類 。 除去血液中蛋白質(zhì)方法較多 ， 主要有溶劑沉淀法與加酶消化法 。 其中以沉淀法使用較多 。 在血樣中加入有機(jī)溶劑 、 酸 、 鹽或重金屬離子可使血漿蛋白沉淀折出 。 其中以生成不溶性鹽沉淀法應(yīng)用較廣 。 某些試劑如酸類和重金屬鹽類可與血漿蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 ，然后通過濾過方法除去沉淀蛋白質(zhì) 。 如在利用比色法測(cè)定血液中磺胺類藥物含量時(shí) ， 通常是利用三氯乙酸來沉淀血液中蛋白質(zhì) ， 然后在酸性條件下進(jìn)行重氮化反應(yīng) ， 顯色后進(jìn)行比色測(cè)定 。 沉淀蛋白質(zhì)的酸類為陰離子型沉淀劑 ， 常見的有三氯乙酸 、 高氯酸 、 鎢酸等 。 重金屬離子蛋白質(zhì)沉淀劑包括汞鹽 、銀鹽 、 鋅鹽 、 銅鹽等 。 酸類沉淀劑在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的 pH值時(shí) ， 可與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 。 重金屬離子與酸類相反 ， 在高于蛋白質(zhì)等電量的 pH值時(shí) ，其陽離子與蛋白質(zhì)中的負(fù)電荷的羧基形成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 。 高氯酸沉淀蛋白質(zhì)時(shí) ， 其酸根可通過加入鉀鹽而消除；三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)時(shí) ， 再用乙醚萃取樣品中的藥物時(shí) ， 由于三氯乙酸可溶于萃取溶劑乙醚中 ， 而干擾測(cè)定結(jié)果 。 有些試劑可使血液中蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析和脫水作用 ， 使蛋白質(zhì)沉淀出來 。 血液包括血漿和血清 ， 實(shí)際上是一種膠體溶液 ，硫酸鈉 、 氯化鈉 、 硫酸銨等中性鹽可破壞該膠體體系中水化膜和改變蛋白質(zhì)表面電荷 ， 使膠體體系不穩(wěn)定而發(fā)生沉淀 。 很多有機(jī)溶劑如乙腈 、 丙酮 、 甲醇可與水發(fā)生混溶 。 在血液蛋白質(zhì)膠體溶液中 ， 也會(huì)使水的介電常數(shù)減小 ， 改變蛋白質(zhì)的電荷數(shù)而破壞水化膜 ， 增加蛋白質(zhì)顆粒靜電引力 ， 使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀 。 生物組織中所含的脂類有時(shí)對(duì)樣品藥物含量測(cè)定產(chǎn)生較大影響 。 此時(shí) ， 可用如石油醚 ， 正已烷等溶劑脫脂 ， 減少對(duì)其儀器測(cè)定 （ 如 HPLC） 的干擾 。 常見有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的用量見表 11－ 1： 表 111 能使 90%以上血漿蛋白發(fā)生沉淀常用有機(jī)溶劑的用量 有機(jī)溶劑 上清液 pH值 每容積血漿加入沉淀劑的容積 甲醇 乙醇 910 乙腈 丙酮 910 用石油醚去脂的用量通常為樣品容積的 35倍 。 有時(shí)為了提高血樣與尿樣中藥物分離萃取的效率，需要將血樣中呈現(xiàn)結(jié)合狀態(tài)的藥物水解出來。在體內(nèi)許多藥物一般在肝臟與葡萄糖醛酸結(jié)合成葡萄糖醛酸甙或與硫酸結(jié)合成硫酸酯，有的可與甘氨酸、醋酸等結(jié)合。 發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的藥物，其極性大大增強(qiáng)，水溶性增加，或在生理 pH值條件下電離度增加，不利于有機(jī)溶劑對(duì)樣品中藥物的萃取。所以，有時(shí)對(duì)樣品中的藥物要作水解處理，使結(jié)合狀態(tài)藥物和代謝物游離出來。 常用的方法有酸水解法 （ HCl） ， 酶水解法 （ β 葡萄糖醛酸甙酶 ， 芳香