【正文】 ................................ 17 4 結論與討論 ............................................... 18 結論 ..................................................... 18 討論 ..................................................... 18 參考文獻 ..................................................... 20 致 謝 ....................................................... 21 河南科技大學畢業(yè)設計（論文） 1 前言 杏鮑菇的分類地位 杏鮑菇 （學名： Pleurotus eryngii），又稱 刺芹菇 、 刺芹側耳 ，是生長于歐洲地中海區(qū)域、中東和北非，但也在亞洲部分地區(qū)生長的食用性菇類。在分類學上杏鮑菇隸屬于真菌界，擔子菌門，傘菌綱，無隔擔子菌亞綱，傘菌目，側耳科，側耳屬 [1]。杏鮑菇春末至夏初腐生兼寄生于傘形花科植物刺芹等的根上和周圍土中，它是高山、草原、沙漠地帶的一種品質優(yōu)良的大型肉質傘菌。杏鮑菇有許多生態(tài)型，各生態(tài)型垂直分布完全不同，主要分布于南歐、 北非、中亞等地區(qū)，我國四川 (九寨溝和長海草地 )、青海、新疆也有分布。 杏鮑菇的作用和價值 杏鮑菇的營養(yǎng)價值 杏鮑菇菌肉肥厚，質地脆嫩，特別是菌柄組織致密、結實、乳白，可全部食用，且菌柄比菌蓋更脆滑、爽口，被稱為 “ 平菇王 ” 、 “ 干貝菇 ” ，具有杏仁香味和如鮑魚的口感，適合保鮮、加工，深得人們的喜愛。菌肉肥厚似鮑魚，因而得名杏鮑菇。杏鮑菇營養(yǎng)豐富，質地脆嫩，口感絕佳，風味獨特，故有 “ 草原上的美味牛肝菌 ” 之美稱。其 食 用方法有干品和鮮品兩種主要方式，通過對杏鮑菇干、鮮品營養(yǎng)成分測定可知，其主要營養(yǎng)成 分齊全，具有很高的營養(yǎng)價值 [2]。新鮮杏鮑菇粗蛋白含量為 20％ ， 粗脂肪為 ％ ， 粗纖維為 ％，灰分為％，礦物質含量較高 [3]， 人體中必需的微量元素鈣、鎂含量是猴頭菇鈣含量20ug/g 的 倍，姬松茸鈣含量 [4]。杏鮑菇的多糖含量為％ 。 已測 17 種氨基酸總量為 ％。其中人體必需氨基酸為 ％，賴氨酸、精氨酸的含量特別高。鉀、磷人體必需元素在杏鮑菇子實體內含量也相當高。 杏鮑菇的藥用價值 杏鮑菇中含有豐富的多糖物質，多糖又稱多聚糖，是由 單糖縮合成的多聚物，廣泛存在于高等植物、動物和微生物中 [5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中能顯著增強癌癥患者抵抗力的生理活性物質即為食用菌多糖。食用菌多糖具有多種生物活性，包括：抗腫瘤 [6]、調節(jié)免疫、降血壓、降血脂、降血糖、健胃保肝、抗病毒，除此之外它還具有抗氧化 [7]、延緩衰老、抗感染、抗輻射、抗水腫、抗疲勞和修復損傷組織細胞等方面的功效。目前，食用菌多糖已廣泛應用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的臨床治療及醫(yī)藥領域的其它用途，如制備醫(yī)用透析膜、藥物緩釋劑、血漿代用品及疫苗等 [8]。 杏鮑菇的經濟價值 杏鮑菇在國內開發(fā)生產時間較 晚 ，但 發(fā)展速度很快 ，由于栽培技術難度較小、產量較高等原因，常規(guī)生產的杏鮑菇市場價格一直偏低，一般均在每千克 46元，超市售價一般為每千克 810 元；夏季反季節(jié)栽培的產品，一般在每千克 10元左右，最高曾達 18 元，而且貨源很少。栽培杏鮑菇的原料很廣泛，棉子殼、闊葉木屑以及棉稈粉、玉米心等均可，輔之以麥麩等即可正常出菇。 河南科技大學畢業(yè)設計（論文） 國內外杏鮑菇液體菌種的研究現(xiàn)狀 液體菌種優(yōu)勢 “ 液體菌種 ” 是用液體培養(yǎng)基，在生物發(fā)酵罐中，通過深層培養(yǎng)（液體發(fā)酵）技術生產的液體形 態(tài)的食用菌菌種。液體指的是培養(yǎng)基物理狀態(tài)，液體深層培養(yǎng)就是發(fā)酵工程技術 [12]。 “ 液體制種 ” 實質是利用生物發(fā)酵工程生產液體菌種，取代傳統(tǒng)、樸素的固體制種；利用生物發(fā)酵原理，給菌絲生長提供一個最佳的營養(yǎng)、酸堿度、溫度、供氧量，使菌絲快速生長，迅速擴繁，在短時間達到一定菌球數(shù)量，完成一個發(fā)酵周期，即培養(yǎng)完畢 [13]。液體菌種具有固體菌種不可比擬的優(yōu)勢： 一、 工藝更簡便 。 液體菌種沒有級別之分，也就是說液體菌種既可以做為母種接原種，也可以做為栽培種直接接栽培袋，簡化了生產工藝。 二、菌種更純 。 液體菌種生產需經過篩 選、提純，屬純菌種；在生產過程中設備封閉運行，是一個選優(yōu)復壯的過程，屬純培養(yǎng)。 三、周期更短 。 采用液體菌種從制種到菌絲長滿栽培袋只需 30 天左右的時間，從制種到出菇大部分品種只需 1 個月，整個生產周期一般也就是兩個月。 四、成本更低 。 用液體菌種無論是生產栽培種還是栽培袋，其菌種成本就 2－ 3 分錢。 五、污染更少 。 采用液體菌種接種后 24 小時萌發(fā)，菌種萌發(fā)速度超過雜菌生長速度，雜菌污染少。 六、操作更簡便 。 液體菌種整個生產過程都是在一個罐體內完成，按鍵操作，既成倍降低了生產、管理費用，又節(jié)省人工，輕松制種。 七、出菇 整齊上市早 。 采用液體菌種的產品可以早上市 2個月以上，早上市與晚上市在效益上差的可就大了。此外，采用液體菌種的栽培袋菌齡短，出菇整齊一致，適合出口要求，在價格上占優(yōu)勢。 國外 杏鮑菇液體菌種 研究現(xiàn)狀 20 世紀中期，微生物液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）技術迅猛發(fā)展，從而形成了現(xiàn)代醫(yī)學、食品發(fā)酵工業(yè)。 1948 年美國科學家 Humfeld 等成功地對蘑菇進行了液體深層培養(yǎng)，從而揭開了人類進行食用菌液體培養(yǎng)和液體菌種研究的序幕，并很快使歐美國家蘑菇生產在五、六十年代快步進入了液體菌種和工業(yè)化栽培時代[9]。近年來，日本 韓國等亞洲國家對香菇、金針菇、平菇液體菌種的研究應用已經很深入，已有許多菇廠開始用中小型發(fā)酵罐生產液體菌種進行栽培。 國內 杏鮑菇液體菌種 研究現(xiàn)狀 我國較早從事食用菌液體深層發(fā)酵研究的是上海植物生理研究所孫美聿等人。 1979 年上海師院的楊慶堯教授開始對香菇、金針菇等培養(yǎng)液體菌種，并進行栽培試驗。自 80 年代至 20 世紀來，我國許多科研院所的專家教授前輩開始對食用菌深層發(fā)酵、液體菌種及中小型發(fā)酵設備進行了反復、深入和刻苦的研究 ， 為今天我國液體菌種的社會化推廣應用，不論在發(fā)酵設備、工藝技術還是在栽培應用 上，都提供了寶貴的經驗，奠定了堅實的基礎 [10]。目前已見的液體菌種生產與應用的食用菌品種，包括平菇、香菇、黑木耳、雙孢菇等常規(guī)品種和白靈菇、杏鮑菇、真姬菇等珍稀品種約五十多個品種 [11]。但對于液體菌種存在的保存期短，易失活，易污染，不便運輸?shù)葐栴}，還未見提出有效的解決辦法。雖然有資料表河南科技大學畢業(yè)設計（論文） 示液體菌種在 04℃ 保存 2— 3個月仍可作菌種，但也有試驗顯示液體菌種 04℃保存超過 3天，菌種的生活力就有所下降，萌發(fā)慢，菌袋易污染。 杏鮑菇液體菌種 生產中 存在的問題 液體菌種雖然在栽培上具有許多優(yōu)點，但目前仍不能 取代固體菌種推廣使用，原因主要有以下 幾 方面 [14]： 1．生產液體菌種的投入比較大。液體菌種生產設備投資大，一家一戶小規(guī)模生產，購買設備不劃算；培養(yǎng)設備需要有電源，而偏遠農村常常停電；液體菌種需要良好的培養(yǎng)環(huán)境，刨造良好的環(huán)境也需要較高的投入。 2．液體菌種生產技術要求較高，需要專業(yè)的技術人員管理，才能保證菌種不受污染。一些小型食用菌生產廠家和一般菇農很難生產出優(yōu)質的液體菌種應用于生產。 3． 液體菌種菌絲球懸浮于液體培養(yǎng)基中，營養(yǎng)易于吸收，菌絲生長快，老化也快，液體菌種一旦生產出來應該及早使用，在接種時間上 缺乏周轉余地，一次性投資大。 因此，目前我國液體菌種只在個別大規(guī)模、工廠化的食用菌生產單位使用 ，而我國目前食用菌生產的現(xiàn)狀是分散的、小規(guī)模的副業(yè)式生產占據(jù)主體，因此科研和生產仍存在著差距，以致成果無法推廣。 研究目的與意義 杏鮑菇的栽培，是以收獲子實體為目的的，并通過市場渠道而獲得經濟效益，菌種雖然不是最終目的，但是重要的中間手段。對杏鮑菇的菌種進行液體培養(yǎng)，單位體積液體培養(yǎng)基中生產菌絲速度快，生產量大，只需 4— 5 天即可生產幾升到幾十升甚至更多。生產的液體菌種可以用作栽培用的母種或原種，也可直接作栽 培種。液體菌種在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)快、定植早、成品率高。據(jù)報道，把杏鮑菇的液體菌種接到固體培養(yǎng)料中，由于液體菌種具有流動性，因而接入的菌種可流散在不同的部位萌發(fā)生長 [15]。 但是液體菌種質量 是影響萌發(fā)出菇的關鍵因素之一，采用質量好的菌種無疑能提高出菇產量。液體菌種培養(yǎng)時間短則菌種活力不足，培養(yǎng)時間長則菌種老化，所以確定適宜的培養(yǎng)周期非常關鍵。 2 試驗材料與方法 試驗材料 供試菌種 杏鮑菇菌株，由河南科技大學提供。 設備儀器 電熱鼓風干燥箱， 霉菌培養(yǎng)箱 ， 立式電 ， 熱壓力蒸汽滅 菌器， 雙數(shù)顯汽浴恒溫振蕩器，離心機，分光光度計。 河南科技大學畢業(yè)設計（論文） 所需藥品 葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素 b，蒸餾水 , 醋酸，醋酸鈉，羧甲基纖維素鈉，可溶性淀粉，酒石酸鉀鈉， 3， 5二硝基水楊酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸氫鉀，鄰聯(lián)甲苯胺，鄰苯二酚等。 實驗用具 80 目篩網(wǎng)，電磁爐， 250ml 三角瓶，試管，燒杯，吸管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，量筒，溫度計，試管架， 100ml 容量瓶， 500ml 容量瓶，比色皿等。 試驗試劑及配制 %可溶性淀粉溶液（ 、 ）； %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、 ）； ， ph=的磷酸鹽緩沖液； ， ph= 的醋酸緩沖液。 試管培養(yǎng)基：采用 PDA 培養(yǎng)基 ， 馬鈴薯 200 克， 葡萄糖 20克，瓊脂 15 克，自來水 1000 毫升，自然 pH。配制方法：現(xiàn)將馬鈴薯洗凈去皮， 再稱取 200g 馬鈴薯切成小塊，加水煮爛。用四層紗布過濾，加熱，再據(jù)實際實驗需要加瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂融完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至 1000 毫升 ，分裝試管，加塞，包扎，滅菌 20 分鐘取出，試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩? 試驗培養(yǎng)基：采用 黃豆粉培養(yǎng)基 [16]， 黃豆粉 30g，葡萄糖 15g，蛋白胨 1g, 磷酸二氫鉀 ， 硫酸鎂 ， 維生素 b 5mg， 水 500ml。配制方法如下：將黃豆粉加水煮沸 30min 后，用 80 目的篩網(wǎng)過濾，取其濾液，加入其他成分，補足水分，分裝在 250ml 的三角瓶中， 121℃ 濕熱滅菌 30min。 一級菌種的制備 ： 母種活化將保存的菌種轉接到無菌的斜面培養(yǎng)基上，放入25℃ 左右恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7— 10 天，得到斜面母種。取 左右的母種菌塊接種于裝有 150ml 一級培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，每瓶 3 塊， 25℃ 下靜置 2 天，然后在溫度 25℃ 、轉速 150r/min，振蕩培養(yǎng) 5 天 [17]。 一級搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖 30g，蛋白胨 2g，瓊脂 4g，磷酸二氫鉀 ，硫酸鎂 ， VBl10mg，水 1000ml， 121℃ 滅菌 20分鐘 [18]。 二級菌種的制備 ： 將一級菌種按試驗要求接種于裝有二級培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，溫度 25℃ 、轉速 120r／ min。 DNS 試劑配制 ：酒石酸鉀鈉 ，溶于 50ml 蒸餾水中 ，加熱，于熱溶液中依次加入 3， 5二硝基水楊酸 ， ，苯酚 ，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至 100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存。但是一定要注意， 3， 5二硝基水楊酸和 NaOH 的加入時間一定要很近，或者是先加入 NaOH。否則會產生難溶的沉淀，導致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過 50℃ 。 測定方法 菌球直徑的測定 取 lml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，按 lml 培養(yǎng)液含菌球大小的數(shù)量比，取 20個菌球在培養(yǎng)皿中排成一列，測總長度，然后計算單個菌球直徑，取 3次求平 均值[19]。 河南科技大學畢業(yè)設計（論文） 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標 ， 菌球直徑（ mm）為縱坐標，繪制曲線。 菌球密度的測定 將培養(yǎng)好的液體菌種搖勻后，取 lml培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)皿下墊方格紙直觀計數(shù)，取 3次求平均值。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標 ， 菌球密度（個）為縱坐標，繪制曲線。 淀粉酶活性的測定 在試管加入 %可溶性淀粉溶液（ 、 ），再加入稀釋 10 倍粗酶液 ，混勻，于 38℃ 水浴保溫 30min，取出后立即加入 DNS 試 劑 ，煮沸 5min 后取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照 [20]（設置三個重復）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標 ， 淀粉酶活性 OD 值 為縱坐標，繪制曲線。 羧甲基纖維素酶（ CMC 酶）活性的測定 在試管中加入 %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、 緩沖液配制） ，加稀釋 10 倍的粗酶液 ， 50℃ 水