原核基因表達(dá)及其調(diào)控-文庫吧
2025-04-22 13:26 本頁面
【正文】 成促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合 當(dāng) CAP與 cAMP協(xié)同作用時(shí)，其對(duì)啟動(dòng)子的親和性發(fā)生增強(qiáng)，而此時(shí)如果葡萄糖的量達(dá)到最低時(shí)，其親和性最高。這樣，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，高濃度的 cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動(dòng)子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。 trp promoter色氨酸啟動(dòng)子 由色氨酸阻遏蛋白進(jìn)行調(diào)控：正調(diào)控作用?？尚纬蓡?dòng)子 阻遏蛋白復(fù)合物。 trp 啟動(dòng)子的脫阻遏可通過： （ 1）移除色氨酸； （ 2）加入色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid） . 3’?吲哚丙烯酸 色氨酸操縱子（ trp operon） 由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的 5種酶組成。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。當(dāng)色氨酸缺乏時(shí)，該阻遏蛋白的前體不能與操縱基因結(jié)合，也就不能發(fā)揮阻遏作用； （ 2）當(dāng)細(xì)胞中的色氨酸濃度較高時(shí)，在衰減子的作用下，操縱子 DNA形成類似終止子的 莖環(huán)結(jié)構(gòu) ，從而只能翻譯出 14肽，稱為前導(dǎo)肽。 IAA是色氨酸的結(jié)構(gòu)競爭類似物，它可以與阻遏蛋白結(jié)合而使其失去阻遏活性；不能再與操縱基因結(jié)合，從而不能阻遏轉(zhuǎn)錄過程。 Ptac 啟動(dòng)子 ： 是來自于 lac和 trp的一組雜合啟動(dòng)子，但是比 lac和 trp都強(qiáng)得多，是一組強(qiáng)啟動(dòng)子。包括： （ 1） PtacI： PlacUV5的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū)； （ 2） PtacII： Ptrp的 35區(qū)（一段合成的包括 Pribnow框在 內(nèi)的 46bp的 DNA） ＋ Plac的操縱基因； （ 3） Ptac12： Plac的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū) 所有 Ptac都受 IPTG的誘導(dǎo)，同時(shí)受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。 PL 啟動(dòng)子 ： 阻遏蛋白 : cI，來源于噬菌體 ?. cI857 : 為 cI溫度敏感突變體 . (1) 將攜帶敏感的 cI857 的細(xì)菌細(xì)胞首先在 28 to 30?C條件下 培養(yǎng)，此時(shí) cI857 阻遏 PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄； (2) 當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)至特定濃度時(shí)（一般是到達(dá)平衡 期），將培養(yǎng)溫度升高至 42?C, 此時(shí) cI857 不再發(fā)生阻 遏作用， PL啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。 PL為 ?噬菌體左向早期啟動(dòng)子，控制基因從 N到 att的早期轉(zhuǎn)錄，受 到 cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控。 ?噬菌體左向操縱子結(jié)構(gòu)示意圖 PL 啟動(dòng)子 (二 )、常用原核表達(dá)載體 大量產(chǎn)物的獲得： （ 1）強(qiáng)的、可調(diào)控的啟動(dòng)子； （ 2） 翻譯效率； （ 3）新生肽穩(wěn)定性等。 mRNA與核糖體的結(jié)合能力： （ 1） RBS與翻譯起始密碼子（ AUG）之間的距離要合適； （ 2）編碼從結(jié)合位點(diǎn)到起始幾個(gè)密碼子之間的的 DNA序 列不應(yīng)含有可能形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的序列，否則會(huì)妨礙 與核糖體的結(jié)合。 優(yōu)良表達(dá)載體的性能 （ 1）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子； （ 2）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）的強(qiáng)弱； （ 3）質(zhì)粒載體及其質(zhì)粒的拷貝數(shù)；是否整合到 染色體 DNA之上； （ 4）合成的外源蛋白在細(xì)胞中的定位； （ 5）宿主的翻譯效率； （ 6）克隆載體所表達(dá)的外源蛋白的穩(wěn)定性。 含 lac 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 多種。其最大的特點(diǎn)是帶有編碼 lacZ（ ?半乳糖苷酶 ）的編碼序列。 當(dāng)外源基因插入后，如果能夠保持正確的 ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和 ?半乳糖苷酶組成的融合蛋白。 所有含 lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到 IPTG的誘導(dǎo)。 pOP20313特點(diǎn) （ 1）為 pBR322衍生質(zhì)粒，插入 了強(qiáng)啟動(dòng)子 PlacUV5并在其下 游加入了 ?半乳糖苷酶 的 編碼序列（ ?gal） 21 bp 片斷和一個(gè) EcoRI位點(diǎn)； （ 2）其融合蛋白的 N端為 ?半乳 糖苷酶的前 7個(gè)氨基酸和 EcoRI接頭編碼的少數(shù)幾個(gè) 氨基酸，其 C端為完整的外 源蛋白。 pOP203系列表達(dá)載體： A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter pOP2031,2, pOP2031 pOP2032 pOP2032 pOP2032 pOP20329 表達(dá)載體 pOP203質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖 含 trp 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： （ 1） 產(chǎn)生的表達(dá)蛋白的量高于 lac啟動(dòng)子； （ 2） 所有含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到 3?吲哚丙烯 酸（ IAA）的誘導(dǎo)。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個(gè)含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，它來源于 p51， trp啟動(dòng)子在 Sma I位點(diǎn)插入，在啟動(dòng)子的下游有 3個(gè)位點(diǎn)， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 質(zhì)粒載體 pDR720結(jié)構(gòu)示意圖 含 tac 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 高表達(dá)效率啟動(dòng)子； 受 IPTG的誘導(dǎo)。 多種商業(yè)化的載體。如： pKK2233。 pBADHisA, B, C。 pTrcHisA, B, C。 pSE420 特點(diǎn)： 1） Ampr； 2） tac啟動(dòng)子； 3） lacZ核糖體結(jié)合部位； 4） ATG起始密碼子，位于 RBS下游 8bp處； 5）來源于 ?噬菌體的終止 子 T1和 T2，以避免其它 基因的過度轉(zhuǎn)錄。 含 PL 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子，所以被廣泛用于各種載體的 構(gòu)建； 如： pPL?。 （ 1）來源于 pBR322, pBR322的 EcoRI/BamHI位點(diǎn) 被 PL 和 N基因取代； （ 2）外源基因可以插入到 N基因中的 HpaI位點(diǎn)； （ 3）當(dāng)培養(yǎng)溫度為 2931?C時(shí)， PL啟動(dòng)子處于阻遏 狀態(tài)；但當(dāng)溫度升到 42?C，發(fā)生脫阻遏。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1