原核基因表達及其調(diào)控-文庫吧
2025-04-22 13:26 本頁面
【正文】 成促進RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合 當 CAP與 cAMP協(xié)同作用時，其對啟動子的親和性發(fā)生增強，而此時如果葡萄糖的量達到最低時，其親和性最高。這樣，當誘導(dǎo)物存在時，高濃度的 cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。 trp promoter色氨酸啟動子 由色氨酸阻遏蛋白進行調(diào)控：正調(diào)控作用?？尚纬蓡幼?阻遏蛋白復(fù)合物。 trp 啟動子的脫阻遏可通過： （ 1）移除色氨酸； （ 2）加入色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid） . 3’?吲哚丙烯酸 色氨酸操縱子（ trp operon） 由啟動子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的 5種酶組成。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。當色氨酸缺乏時，該阻遏蛋白的前體不能與操縱基因結(jié)合，也就不能發(fā)揮阻遏作用； （ 2）當細胞中的色氨酸濃度較高時，在衰減子的作用下，操縱子 DNA形成類似終止子的 莖環(huán)結(jié)構(gòu) ，從而只能翻譯出 14肽，稱為前導(dǎo)肽。 IAA是色氨酸的結(jié)構(gòu)競爭類似物，它可以與阻遏蛋白結(jié)合而使其失去阻遏活性；不能再與操縱基因結(jié)合，從而不能阻遏轉(zhuǎn)錄過程。 Ptac 啟動子 ： 是來自于 lac和 trp的一組雜合啟動子，但是比 lac和 trp都強得多，是一組強啟動子。包括： （ 1） PtacI： PlacUV5的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū)； （ 2） PtacII： Ptrp的 35區(qū)（一段合成的包括 Pribnow框在 內(nèi)的 46bp的 DNA） ＋ Plac的操縱基因； （ 3） Ptac12： Plac的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū) 所有 Ptac都受 IPTG的誘導(dǎo)，同時受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。 PL 啟動子 ： 阻遏蛋白 : cI，來源于噬菌體 ?. cI857 : 為 cI溫度敏感突變體 . (1) 將攜帶敏感的 cI857 的細菌細胞首先在 28 to 30?C條件下 培養(yǎng)，此時 cI857 阻遏 PL啟動子的轉(zhuǎn)錄； (2) 當細菌細胞被培養(yǎng)至特定濃度時（一般是到達平衡 期），將培養(yǎng)溫度升高至 42?C, 此時 cI857 不再發(fā)生阻 遏作用， PL啟動子開始啟動轉(zhuǎn)錄過程。 PL為 ?噬菌體左向早期啟動子，控制基因從 N到 att的早期轉(zhuǎn)錄，受 到 cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控。 ?噬菌體左向操縱子結(jié)構(gòu)示意圖 PL 啟動子 (二 )、常用原核表達載體 大量產(chǎn)物的獲得： （ 1）強的、可調(diào)控的啟動子； （ 2） 翻譯效率； （ 3）新生肽穩(wěn)定性等。 mRNA與核糖體的結(jié)合能力： （ 1） RBS與翻譯起始密碼子（ AUG）之間的距離要合適； （ 2）編碼從結(jié)合位點到起始幾個密碼子之間的的 DNA序 列不應(yīng)含有可能形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的序列，否則會妨礙 與核糖體的結(jié)合。 優(yōu)良表達載體的性能 （ 1）強轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子； （ 2）核糖體結(jié)合位點（ RBS）的強弱； （ 3）質(zhì)粒載體及其質(zhì)粒的拷貝數(shù)；是否整合到 染色體 DNA之上； （ 4）合成的外源蛋白在細胞中的定位； （ 5）宿主的翻譯效率； （ 6）克隆載體所表達的外源蛋白的穩(wěn)定性。 含 lac 啟動子的表達載體： 多種。其最大的特點是帶有編碼 lacZ（ ?半乳糖苷酶 ）的編碼序列。 當外源基因插入后，如果能夠保持正確的 ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和 ?半乳糖苷酶組成的融合蛋白。 所有含 lac啟動子的表達載體都受到 IPTG的誘導(dǎo)。 pOP20313特點 （ 1）為 pBR322衍生質(zhì)粒，插入 了強啟動子 PlacUV5并在其下 游加入了 ?半乳糖苷酶 的 編碼序列（ ?gal） 21 bp 片斷和一個 EcoRI位點； （ 2）其融合蛋白的 N端為 ?半乳 糖苷酶的前 7個氨基酸和 EcoRI接頭編碼的少數(shù)幾個 氨基酸，其 C端為完整的外 源蛋白。 pOP203系列表達載體： A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter pOP2031,2, pOP2031 pOP2032 pOP2032 pOP2032 pOP20329 表達載體 pOP203質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖 含 trp 啟動子的表達載體： （ 1） 產(chǎn)生的表達蛋白的量高于 lac啟動子； （ 2） 所有含 trp啟動子的表達載體都受到 3?吲哚丙烯 酸（ IAA）的誘導(dǎo)。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個含 trp啟動子的表達載體，它來源于 p51， trp啟動子在 Sma I位點插入，在啟動子的下游有 3個位點， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 質(zhì)粒載體 pDR720結(jié)構(gòu)示意圖 含 tac 啟動子的表達載體： 高表達效率啟動子； 受 IPTG的誘導(dǎo)。 多種商業(yè)化的載體。如： pKK2233。 pBADHisA, B, C。 pTrcHisA, B, C。 pSE420 特點： 1） Ampr； 2） tac啟動子； 3） lacZ核糖體結(jié)合部位； 4） ATG起始密碼子，位于 RBS下游 8bp處； 5）來源于 ?噬菌體的終止 子 T1和 T2，以避免其它 基因的過度轉(zhuǎn)錄。 含 PL 啟動子的表達載體： 是一種極強的啟動子，所以被廣泛用于各種載體的 構(gòu)建； 如： pPL?。 （ 1）來源于 pBR322, pBR322的 EcoRI/BamHI位點 被 PL 和 N基因取代； （ 2）外源基因可以插入到 N基因中的 HpaI位點； （ 3）當培養(yǎng)溫度為 2931?C時， PL啟動子處于阻遏 狀態(tài)；但當溫度升到 42?C，發(fā)生脫阻遏。
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