westernblot詳解及問題分析-文庫吧
2025-04-21 00:44 本頁面
【正文】 2 SDSPAGE上樣緩沖液： ? DTT可臨用前以 1： 4比例混合加入，亦可全部配好分裝， 20℃ 凍存。 ? 按 1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合， 95～ 100℃ 加熱 5～ 15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為 2025μl，總蛋白量 20～50μg。 1M TrisHCl() 10 ml 1M DTT 20 ml SDS 4 g 甘油 20 ml 溴酚藍(lán) g 總體積 100ml ① 100mM TrisHCl() ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ %溴酚蘭 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O Western Blot SDS： ? 陰離子去污劑 變性劑 ? 氨基酸側(cè)鏈與 SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS膠束。 ? 蛋白質(zhì) SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。 ? 與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。 Western Blot 蛋白質(zhì) SDS膠束的特點(diǎn)： （ 1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒 （ 2）平均 1g 蛋白質(zhì)結(jié)合 SDS （ 3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基 SDS膠束基本上是相同的 （ 4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比 Western Blot ? 不連續(xù)的電泳緩沖體系。 ? SDS— 蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 Western Blot SDSPAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入 SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液， SDS是一種很強(qiáng)的 陰離子表面活性劑 ，它可以 斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵 ，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇， DTT） 可以 斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) 。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與 SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物。 蛋白質(zhì)分子結(jié)合 SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。 【 SDSPAGE基本原理 】 Western Blot 凝膠成分 ? 丙烯酰胺和 N,N’亞甲雙丙烯酰胺 ?? ? SDS ? 配膠的 Tris緩沖液 ? TEMED ? 過硫酸銨 ? Tris甘氨酸電泳緩沖液 Western Blot PAGE：聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 (polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰 胺 (acrylamide，簡(jiǎn)稱 Acr)和交聯(lián)劑 (crosslinker) N,N’亞甲基雙丙烯酰胺 (N,N’methylenebisacylamide， 簡(jiǎn)稱 Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)的凝膠。化學(xué)惰性強(qiáng)，具有一定
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