20xx年醫(yī)學(xué)專題—cd147在胃癌細(xì)胞sgc7901增殖(已改無(wú)錯(cuò)字)
2024-10-31 14 本頁(yè)面
【正文】 )，與經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切的pSilencer3.1neo質(zhì)粒連接，構(gòu)建成CD147 shRNA表達(dá)載體，重組質(zhì)粒分別命名為pSilencershRNA1， pSilencershRNA2 和pSilencershRNAcontrol 。,第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。,重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定(ji224。nd236。ng)結(jié)果,DNA測(cè)序表明，3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建(ɡ242。u ji224。n)正確。,pSilencer/shRNA1測(cè)序圖（紅線為插入片段）,第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。,轉(zhuǎn)染及篩選(shāixuǎn),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全(w225。nqu225。n)培養(yǎng)基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽(yáng)性細(xì)胞克隆用有限稀釋法分離出來(lái)并逐步擴(kuò)增以待進(jìn)一步分析。篩選出的細(xì)胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNAcontrol。,第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)。,Realtime PCR檢測(cè)(jiǎn c232。)CD147 mRNA表達(dá)水平,與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細(xì)胞中CD147 mRNA相對(duì)表達(dá)(biǎod225。)量分別下降至72.4%和17.3% 。,第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。,Lane 1: SGC7901. Lane 2: SGC7901/shRNAcontrol Lane 3: SGC7901/shRNA1 Lane 4: SGC7901/shRNA2,HG代表(d224。ibiǎo)高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot結(jié)果與Realtime PCR結(jié)果相符。,第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。,抑制率(%)=(對(duì)照組A 值實(shí)驗(yàn)組A 值)／對(duì)照組A 值100%,24h、48h、72h 時(shí)間(sh237。jiān)點(diǎn),MTT細(xì)胞增殖(zēngzh237。)實(shí)驗(yàn),第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。,與SGC7901和SGC7901/shRNAcontrol相比，培養(yǎng)24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細(xì)胞增殖(zēngzh237。)能力均顯著降低.而陰性對(duì)照組SGC7901/shRNAcontrol增殖能力無(wú)顯著改變。,第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。,明膠酶譜法檢測(cè)(jiǎn c232。)細(xì)胞上清中MMP2和MMP9的活性,明膠酶包括72 kDa的明膠酶A（基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP2）和92 kDa的明膠酶B (基質(zhì)金屬蛋白酶9，MMP9)。其作用底物(dǐ w249。)為基底膜中的Ⅳ型膠原和變性的間質(zhì)膠原（明膠），其活性與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。,第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。,明膠酶譜法是一種測(cè)定明膠酶活性的常用方法。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開(kāi)，顯示兩條負(fù)染條帶，根據(jù)條帶的面積(mi224。n jī)和亮度可判定明膠酶的活性。,第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。,明膠(m237。nɡ jiāo)酶譜結(jié)果,SGC7901/shRNA2細(xì)胞(x236。bāo)上清液中MMP2
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