重組dna技術(shù)1-在線瀏覽
2025-01-20 23:21本頁面
【正文】 主菌 ? 微量的目的基因必須經(jīng)過基因克隆獲得大量的拷貝后 ， 才能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的重組 、 轉(zhuǎn)化和表達(dá)等操作 。 分子刀 DNA限制性內(nèi)切酶 識別特定的核苷酸序列 4~6個堿基對 形成粘性末端或平端 重組 DNA的操作 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了 200多種 ? EcoRI特異識別GAATTC及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段 ? 粘性末端 ? T4連接酶 基因體外重組 The formation of a rebinant DNA molecule 載體 載體是運(yùn)送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具 ， （ 1） 能夠 自我復(fù)制 ， 并帶動插入的外源基因一起復(fù)制 （ 2） 具有合適的 限制性酶切位點(diǎn) （ 3） 具有合適的 篩選標(biāo)記 （ 4） 細(xì)胞內(nèi) 拷貝數(shù)要多 （ 5） 載體的 分子量要小 （ 6） 細(xì)胞內(nèi) 穩(wěn)定性高 目前最常用的載體包括 細(xì)菌質(zhì)粒 、 l噬菌體 、 cosmid質(zhì)粒等 。 進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù) 。 這一過程就是 遺傳轉(zhuǎn)化 。 對表達(dá)產(chǎn)物分離純化便可獲得想要的產(chǎn)品 。 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化子的篩選 宿主菌或受體細(xì)胞 ? 大腸桿菌 ? 酵母 ? 昆蟲細(xì)胞 ? 哺乳動物細(xì)胞 ? 感受態(tài)細(xì)胞（ petent cell） 受體細(xì)胞和重組基因的導(dǎo)入 （ 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 ） ? 將目的基因克隆到 大腸桿菌細(xì)胞 中的操作步驟： 1． 獲得目的基因和質(zhì)粒載體； 2． 形成重組質(zhì)粒； 3． 制備感受態(tài)細(xì)胞 ， 用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞； 4． 培養(yǎng)大腸桿菌 ， 讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝； 5． 篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞 ， 進(jìn)行檢查或鑒定 。 在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因，破壞了 lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成 白色的克隆 利用 lacZ基因的插入失活 篩選重組質(zhì)粒 篩選克隆 pUC18載體還攜帶了 抗生素 （ antibiotic） 基因 ， 可 篩選重組質(zhì)粒 。 The Human Genome Project ? 1988年，美國國家衛(wèi)生院和能源部 迄今為止在生命科學(xué)領(lǐng)域最宏大的研究計劃 — 人類基因組計劃 ? 主要內(nèi)容是完成人體 23對染色體的全部基因的遺傳作圖和物理作圖，完成 23對染色體上 30億個堿基的序列測定 ? 以美國為主、包括英國、法國、日本和中國多國科學(xué)家參加的國際合作計劃 人類基因組計劃 基因組 ?細(xì)胞內(nèi)染色體的總和，基因組亦稱染色體組 國際合作計劃 ?美國，英國，法國，德國，日本共同參加人基因組的大規(guī)模測序 ?中國 1999年 7月正式承擔(dān)人基因組的1%的測序工作。 基因組大小 生物
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