轉(zhuǎn)基因鑒定與安全性評估-在線瀏覽
2025-03-30 22:44本頁面
【正文】 SDS方法提取 gDNA 研磨的組織細(xì)胞用熱的 SDS裂解后，加入高濃度的 KAc， 0℃ 放置以除去蛋白和多糖類雜質(zhì)，最后用乙醇或異丙醇沉淀。 2 向管中加入 50μL20%SDS溶液，混勻，不可過于強(qiáng)烈震蕩以防 基因組 DNA斷裂 ， 65℃ 保溫 10min，并不時(shí)搖動。 4 4℃ ,15 000rpm離心 15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入 ，混勻， 20℃ 沉淀 30 min 。 6 加入 1/10體積的 RNaseA， 37℃ 保溫 20min，除去 RNA。 12 000rpm離心 10min回收 基因組 DNA沉淀。 （ 2）核酸分子雜交法 ? 核酸雜交 探針 ：同位素標(biāo)記等 樣品： 轉(zhuǎn)印好的膜 溫度： 65℃ 緩沖液： SSC 鮭魚精 DNA：扣除非特異雜交背景 ? 一、提取基因組總 DNA ? 二、基因組 DNA的限制酶切 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定酶切 DNA的量。 三、基因組 DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（ 200bp50kb），實(shí)驗(yàn)成本低。 2. 電泳：電泳樣品中加入 6 Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加 DNA Marker。 ? 四、 DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物 （一）試劑準(zhǔn)備 １．變性液： NaOH； M NaCl。 ３．轉(zhuǎn)移液（ 20 SSC）： NaCl 。 （二）操作步驟 :室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中 30min。 3．轉(zhuǎn)移 ：轉(zhuǎn)移液用 20 SSC。整個(gè)操作過程中要防止膜上沾染其他污物。 C烘 2hr，然后將 NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。 探針的標(biāo)記方法有隨機(jī)引物法、切口平移法和末端標(biāo)記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。 2．在另一個(gè) ： Labeling 5 buffer 10μ l（含有隨機(jī)引物） dNTPmix 2μ l(含 dCTP、 dGTP、 dTTP 各 ) BSA（小牛血清白蛋白） 2μl [a32P]dATP 3μl Klenow酶 5U 3．將變性模板 DNA加入到上管中，加 ddH2O至 50μl，混勻。 4．加 50μl 終止緩沖液終止反應(yīng)。 1．預(yù)雜交 NC膜浸入 2 SSC中 5min，在雜交瓶中加入雜交液（ 8cm 8 cm的膜加 5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。取經(jīng)超聲粉碎的鮭魚精 DNA（已溶解在水或 TE中） 100℃ 加熱變性 5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達(dá)到 100μg/ml。鮭魚精 DNA的作用是封閉 NC膜上沒有 DNA轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，降低雜交背景、提高雜交特異性。將探針 100℃ 加熱 5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。 七、洗膜與檢測 SSC和 SDS NP MIP2OE1 MIP2OE3 MIP2OE5 MIP2OE8 MIP2OE9 NP 利用 Southern Blot檢測目的基因拷貝數(shù) （ 2） RNA轉(zhuǎn)錄水平 RTPCR 和 QPCR檢測 mRNA cDNA PCR A MIP1 ACT 0 5 10 15 20 25 30 35 NP MIP1OE2 B 蛋白水平 翻譯水平 是利用抗原 抗體特異結(jié)合原理檢測外源基因表達(dá)產(chǎn)物特異蛋白質(zhì)的生成，是將蛋白質(zhì) 電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測方法。 加入 Western封閉液，在搖床上緩慢搖動 ,室溫封閉 60分鐘。 一抗孵育 (Primary antibody incubation) 參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用 Western一抗稀釋液稀釋一抗?；蛘咴?4℃ 緩慢搖動孵育過夜。 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation) 參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用 Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗。 洗滌 3次 蛋白檢測 (Detection of proteins) 參考相關(guān)說明書，使用 BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等 ECL類試劑來檢測蛋白。如果沒有自動洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。 （ 1）植物中的甲基化可以進(jìn)行傳遞，當(dāng)甲基化傳遞進(jìn)轉(zhuǎn)基因中時(shí)，就會導(dǎo)致基因沉默。 （ 3）有時(shí)轉(zhuǎn)基因以單拷貝插入一個(gè)高甲基化位點(diǎn)也能引起轉(zhuǎn)錄基因沉默 。 重復(fù)序列誘導(dǎo)基因沉默 ? 外源基因多拷貝形式整合到同一位點(diǎn) 重復(fù)序列自發(fā)配對 甲基化酶特異識別這種配對結(jié)構(gòu)進(jìn)而使其甲基化，或異染色質(zhì)化相關(guān)蛋白識別重復(fù)序列間配對形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 轉(zhuǎn)錄后基因沉默（ PTGS） ? 轉(zhuǎn)錄后基因沉默：轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行但 mRNA不能積累而發(fā)生的基因沉默。 ? PTGS在單倍體和純合體中發(fā)生的概率較雜合體要高，表現(xiàn)出基因劑量效應(yīng)；使用雙增強(qiáng)子的 35s啟動子比使用經(jīng)典的 35s啟動子發(fā)生 PTGS的頻率要高。 二、轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性 ? 減數(shù)分裂配子形成過程中丟失 ? 外源 DNA是在細(xì)胞質(zhì)基因組中整合 ? 配子中外源 DNA引起致死突變 ? 外源基因插入引起的基因重排、丟失 ? 外源 DNA的共抑制效應(yīng)及甲基化使基因失活 三、轉(zhuǎn)基因的遺傳規(guī)律 ? 單位點(diǎn)插入 孟德爾單基因遺傳規(guī)律 ? 多位點(diǎn)插入 較為復(fù)雜 四、轉(zhuǎn)化方法對整合的外源基因結(jié)構(gòu)及遺傳特性的影響 ? 農(nóng)桿菌侵染方法 ? TDNA串聯(lián)、 TDNA截短 ? 直接轉(zhuǎn)化 DNA的方法 ? 發(fā)生 DNA環(huán)化甲基化、片段分離以及丟失和重排等 已經(jīng)整合到基因組中的能穩(wěn)定遺傳 轉(zhuǎn)基因的安全性及安全評價(jià) ? 轉(zhuǎn)基因食品安全嗎？ ? 面對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的爭議，轉(zhuǎn)基因?yàn)槿祟悗淼睦婧惋L(fēng)險(xiǎn)，我們的路該怎樣走？ 對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個(gè)典型的事件。 后果： 綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。 斑蝶事件： 1999年 5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在《 Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致 44％的幼蟲死亡。 斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。 基因漂流并不是從轉(zhuǎn)
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1