轉(zhuǎn)基因鑒定與安全性評(píng)估-展示頁(yè)
2025-03-04 22:44本頁(yè)面
【正文】 度計(jì)測(cè)定，又可直接觀察到植物組織由沉淀形成的藍(lán)色斑點(diǎn) 轉(zhuǎn)基因愈傷組織的 GUS顯色 EDTA solution Na2 HPO4 1M NaH2PO4 100mM K4Fe (CN)6 100mM K3Fe (CN)6 10% TritonX100 (Invitrogen) 100 μL 10 mM 784 μL 158 μL 25 μL mM 25 μL mM 50 μL % 100 μL DMSO containing mg XGluc 2 mM NaPO4 buffer () GFP（ Green Fluorescence Protein) GFP 395nm470nm 505nm YFP 527nm CFP 433nm 476nm 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) 馬丁 300mg/l 80mg/l 浸泡種子 浸泡幼苗葉片 噴施幼苗 2．利用報(bào)告基因 gus基因、螢火蟲熒光素酶基因等，應(yīng)用較為廣泛的是 gus基因，即 β 葡糖苷酸酶基因。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi) (光強(qiáng)為10,000 μmol/m2/s, 光照時(shí)間為 12 h/d, 溫度為 29℃ ), 觀察種子發(fā)芽情況 , 7 d后統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和白化死亡率。 檢測(cè)潮霉素抗性的葉片放入含一定體積 (約 30 rn1)檢測(cè)溶液的平皿中，在 12 h光照／ 12 h黑暗、 26℃ 條件下培養(yǎng)，定期觀察葉片變色情況，以判斷其抗性水平。三、轉(zhuǎn)基因的檢測(cè) ? （一）遺傳標(biāo)記法 – 在表達(dá)載體中安裝選擇性基因 ? 如對(duì)某種抗生素的抗性基因，對(duì)某種除草劑的抗性基因等 – 在表達(dá)載體中安裝報(bào)告基因 ? 轉(zhuǎn)化處理過的受體在相同條件下都能生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)化體具有非轉(zhuǎn)化體所不具有的某種特殊表現(xiàn)（稱為顯性的報(bào)告基因），或者轉(zhuǎn)化體不具有非轉(zhuǎn)化體的表現(xiàn)（稱為隱性的報(bào)告基因）。 1. 利用選擇性基因 ☆ 篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植株常用的選擇劑：抗生素類有卡那霉素、潮霉素 B等；除草劑類有草甘膦、雙丙氨膦、綠黃隆等。檢測(cè)溶液為含 1 mg／ L 芐氨基嘌呤 (6BA)及100mg／ L潮霉素 B的水溶液 . 浸種培養(yǎng)至破胸時(shí) , 分放在裝有不同濃度 G418溶液的培養(yǎng)皿中 , 培養(yǎng)皿底覆蓋有兩層濾紙。 每片葉剪成 2 cm左右長(zhǎng)的葉段放入裝有 G418的培養(yǎng)皿中 , 將葉片置于室內(nèi)室溫下 (光強(qiáng)約為 10,000 μmol/m2/s, 光照時(shí)間約為 12 h/d, 溫度約為 25℃ ), 定期觀察其變化情況。 gus基因來自細(xì)菌，所編碼的 β 葡糖苷酸酶，與 5溴 4氯 3吲哚 β D葡糖苷酸酯（簡(jiǎn)稱為 XGluc）的底物發(fā)生作用時(shí)，能產(chǎn)生藍(lán)色沉淀反應(yīng)。沙爾菲 下村修 錢永健 2023年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) cyan fluorescent protein yellow fluorescent protein （二）分子生物學(xué)方法檢測(cè) DNA水平 （ 1） PCR CK 轉(zhuǎn)基因個(gè)體 ? 模板 template ? 引物 primer ? dNTP ? Taq ? 反應(yīng)緩沖液：離子 Mg2+等 （ 90℃ 96℃ ）：雙鏈 DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈 DNA （ 25℃ 65℃ ）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 現(xiàn)在有些 PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使 Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在 60℃ 65℃ 間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 gDNA提取方法 CTAB法 SDS法 （ 1） DNA extraction buffer : final concentration sorbitol sorbitol(S29) 山梨醇 Tris 200ml of 1M Tris, 5mM EDTANa2 10ml EDTA add distill H2O to 1 liter Adjust pH to with HCL. （ 2） Nuclei lysis buffer: final concentration Tris 200ml of 1M Tris, 50mM EDTANa2 100ml EDTA NaCl 117g NaCl (S13) 2%CTAB 20g CTAB(C11) 十六烷基三甲基溴化銨 add distill H2O to 1 liter （ 3） 5% sarkosyl: 50g per liter of Nlauroylsarcosine sodium salt (L1). Prepare extraction buffer: 1vol. DNA extraction buffer, 1vol. Nuclei lysis buffer and . 5% sarkosyl. Before use, add Nabissulfite to a concentration of ().Mix gently, warm up to 65℃ if too viscous. CTAB （ 1）取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入 ml Eppendorf管中； （ 2）加入 800 μl的 CTAB提取緩沖液，混勻（ CTAB在 65℃ 水浴預(yù)熱），每 5min輕輕震蕩幾次， 20min后 12023 r/min，離心 15 min； （ 3）小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各 400μl）溶液，混勻，4℃ ， 12023 r/min，離心 10 min； （ 4）小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻， 4℃ ， 12023 r/min，離心 10 min。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1