廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè)多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見(jiàn)稿-在線瀏覽
2024-09-30 18:44本頁(yè)面
【正文】 華、屈素潔、王海清、鄒聯(lián)斌、蒙振畝、粟艷瓊、李軍。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的鑒別檢測(cè)。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV又稱豬藍(lán)耳病病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，其基因組為單股正鏈 RNA。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型變異株 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HPPRRSV指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位氨基酸和第 533?561 位氨基酸出現(xiàn) 30 個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失為特征的、以 JXA1毒株為代表的高致病性美洲基因型豬繁殖與呼吸綜合征病毒?！∝i繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株 porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain，VPRRSVDB45/T XXXXX—XXXX2指HPPRRSV TJ毒株在 Marc145 細(xì)胞上傳代至 92 代后獲得的致弱疫苗毒 TJMF92 株?！》崔D(zhuǎn)錄 reverse transcription，RT以RNA為模板合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的過(guò)程。 多重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng) multiplex realtime polymerase chain reaction，Multi realtime PCR簡(jiǎn)稱多重?zé)晒舛?PCR，是 PCR 技術(shù)的一種特殊形式。3 材料準(zhǔn)備 試劑 特異性引物及探針引物和探針序列見(jiàn)附錄?A?中的表 。L?！》崔D(zhuǎn)錄試劑盒商業(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒主要成分見(jiàn)附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗(yàn)證合格?！x器設(shè)備及耗材 儀器設(shè)備本方法使用下列儀器設(shè)備：a）熒光定量 PCR 儀；b）核酸蛋白分析儀；DB45/T XXXXX—XXXX3c）高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；d）組織勻漿機(jī)；e）混勻器；f）微量移液器。注：離心管、PCR 反應(yīng)管、吸頭、熒光PCR反應(yīng)管等應(yīng)使用無(wú) RNA 酶的一次性塑料制品。4 操作方法 操作環(huán)境以下操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)或II級(jí)以上防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、無(wú)RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行。以 10 000 g離心 5 min，收集上清，用于總 RNA 抽提，或置 20 ℃保存?zhèn)溆??！〈龣z樣品總 RNA 提取取 200 181?！》崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為?10 ?181。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）10?RT 緩沖液：1?181。L）：?181。L ；d）RNA?酶抑制劑（40 U/181。L；e）MgCl 2溶液（25 mM/L）：2?181。L）：?181。L；h）滅菌雙蒸水：補(bǔ)足總體積至 10 181。DB45/T XXXXX—XXXX4加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ?℃，10 min；42 ?℃，30 min；95 ?℃，5 min?！《嘀?zé)晒舛?PCR反應(yīng)總體積為?25 ?181。在冰浴條件下，在熒光?PCR?反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）Premix Ex Taq 聚合酶： 181。L；c）NAPRRSVF、NAPRRSVR 引物（25 pmol/181。L；d）TJMPRRSVF,TJMPRRSVR 引物（25 pmol/181。L；e）NAVPRRSVP 探針（25 pmol/181。L；f）NACPRRSVP 探針（25 pmol/181。L；g）TJMPRRSVP 探針（25 pmol/181。L；h）反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA：2 181。L。將熒光 PCR 反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀內(nèi)，按如下程序進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性 95 ℃20 s；95 ℃5 s；56 ℃20 s ，共 40 個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)分別收集FAM、JOE和TAMRA通道的熒光信號(hào)?！￡?yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照以CPRRSV VR2332毒株、HPPRRSV JXA1毒株、VPRRSV TJMF92毒株的cDNA為陽(yáng)性對(duì)照?；蛘?，使用CPRRSV pCNsp2 質(zhì)粒、HPPRRSV pVNsp2 質(zhì)粒及VPRRSV pTJMNsp2質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。注：重組質(zhì)粒pCNsppVNs
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