【正文】 對(duì)基因治療的發(fā)展尤為重要，其有效開發(fā)將推動(dòng)基因治療向常規(guī)治療方法的轉(zhuǎn)變 [1]。脂質(zhì)體在所有已用于臨床試驗(yàn)的基因載體中僅次于病毒載體，居第二位，是最有發(fā)展前景的非病毒載體。陽離子類脂在作為基因載體和藥物傳遞等方面的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。其中包括被稱作“載體法” 的方法，此方法包括使用載體促進(jìn)生物活性劑胞內(nèi)傳遞到特定靶細(xì)胞如疾病細(xì)胞內(nèi)。例如，脂質(zhì)體和聚合物已被用于轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)，包括脫氧核糖核酸(DNA) 和核糖核酸 (RNA) [3]。此外，目前可用載體在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面的應(yīng)用也是有限的。此外，它們對(duì)于生物活性劑在血清內(nèi)的胞內(nèi)傳遞一般也是無效的。實(shí)質(zhì)上，在包含陽離子類脂和陽離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染研究過程中，通常需要從組織培養(yǎng)浴中移去血清。這樣必須包括附加操作步驟，從而使得陽離子類脂和陽離子脂質(zhì)體感染細(xì)胞變得復(fù)雜和麻煩。在如何獲得陽離子類脂方面，人們提出了許多合成方案，但還不甚完善，需要進(jìn)一步探討和研究。近年來，人們研制開發(fā)了陽離子類脂，如 N,Nˊ二（十二烷基氨基羰基亞甲基）N,N’二 (βN,N二甲基氨基乙基氨基碳基亞甲基)亞環(huán)己基1,4二胺(CDTALADMA) 和N,Nˊ 二( 十二烷氧基碳基亞甲基)N,N ˊ二(βN,N,N三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)乙二胺二碘化物。就陽離子類脂的合成目前國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，還不能得到較高的產(chǎn)率，而且原料蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文2也不太容易獲得，而本課題采用蔗糖為原料來合成蔗糖酯類陽離子類脂，不僅原料易得而且也能獲得一個(gè)較好的收率。細(xì)胞膜為選擇性屏障，它能阻止物質(zhì)隨機(jī)進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)。因此陽離子類脂在作為基因載體在基因治療方面必將具有廣闊的應(yīng)用前景。 國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)綜述基因治療是現(xiàn)代癌癥治療的熱點(diǎn)，并且正在逐步變成現(xiàn)實(shí)。然而裸露的治療基因容易被核酸酶降解，表現(xiàn)出很差的細(xì)胞攝取效率。病毒載體可以有效的轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞，但它們有很多不足，比如容易致突變，可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答從而使得基因表達(dá)消失。非病毒載體中的載體有一系列工藝優(yōu)勢(shì)，比如制備簡(jiǎn)單，儲(chǔ)存穩(wěn)定，耐熱壓滅菌和冷凍干燥等等。目前的研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，毒性仍然是這類載體應(yīng)用于基因治療的主要障礙，而載體的毒性主要取決于制備過程中使用的陽離子類脂 [7]。自那時(shí)以來，一些出版的報(bào)紙對(duì)用于基因傳遞的陽離子脂質(zhì)體的合成方案進(jìn)行了報(bào)道，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。目前，合成陽離子類脂的方法有很多，這主要是采用的原料不同從而得到的陽離子類脂的骨架不同的原因。而蔗糖酯類陽離子類脂的合成目前國(guó)內(nèi)還沒有相關(guān)的報(bào)道，本課題應(yīng)用蔗糖為原料進(jìn)行蔗糖酯類陽離子類脂的合成，要經(jīng)過蔗糖三羧酸酯中間體的合成，然后再進(jìn)行酯交換鹵化等步驟 [9]。本文以 1’,6’蔗糖二酯鹵化得到目的產(chǎn)物作為重點(diǎn)討論蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文3部分，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。 OOHHO OHOOCORHOROCH I2P(h)3imidazoleDMF OIHO OHOOCORHOROCHE 初步設(shè)計(jì)吹 HCL 法的 C6 位羥基選擇性鹵化反應(yīng)酯化物( mol)與三甲基氯硅烷 TMSCl( mol， g)混合液中加如 DMSO( mol, g),反應(yīng)用 HCl 吹掃 1 分鐘，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 10 分鐘，產(chǎn)物視性質(zhì)純化處理。1 蔗糖6乙酸酯的合成 OOHHOOHOOHOHOHHCH3(OCH3)364S3 OOHOHOOHOHOHHOOCH3H3CO cyleopenig4Ac6Ac OAcHO OHOOHOHOHH 2 蔗糖6 乙酸酯的選擇性氧化 OAcHO OHOOHOHOHHONaOCl/NaBr/TEMPOH2pH 10 OAcHO OHOCONaOHNaOCHHCl OAcHO OHOCOHOHHOCHOAcHO OHOHOHOHHONaOCl/TEMPOH2pH 10OAcHO OHCONaOHNaOCHHClOAcHO OHCOHOHHOCH50Kz ultrasound B3 羧酸酯化蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文64 羥基去保護(hù) 5 鹵化 初步設(shè)計(jì)試驗(yàn)步驟 C6 羥基保護(hù)（蔗糖6乙酸酯的合成）干燥蔗糖（ g, mol，真空干燥箱中 60 ℃干燥 24 h）于三頸燒瓶中，加 50 mL DMF,緩慢滴加原乙酸三甲酯（ mL, mol）及對(duì)甲苯磺酸（75 mg, mmol）溶液，劇烈攪拌，室溫下反應(yīng) 150 min，溶液無色透明，加蒸餾水（5 mL） ，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 30 min，加特丁胺（ mL, mol） ，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 70 min，pH 值約為 9，中和，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將 DMF 蒸出，結(jié)晶得到白色晶體蔗糖6乙酸酯（A ） 。2 ℃，每隔 30 min 用酸度計(jì)測(cè)量反應(yīng)溶液的 pH值，并用 的氫氧化鈉控制 pH 在 10 反應(yīng)之間為 10 小時(shí)（為避免酯水解反應(yīng)時(shí)間應(yīng)盡量短） 。方案二：取前一步驟產(chǎn)物 g（2 mmol） ，TEMP g（ mmol）以及NaBr g（ mmol）溶于 25 mL 冷水中成溶液，21%次氯酸鈉溶液 mL 加至上溶液中，用冰水浴控制反應(yīng)溫度控制在 5177。每隔 20 min 用酸度計(jì)測(cè)量反應(yīng)溶液的 pH 值，并用 的氫氧化鈉控制 pH 在 反應(yīng)之間為 6 小時(shí)（為避免酯水解反應(yīng)時(shí)間應(yīng)盡量短） 。 羧酸酯化在裝有溫度計(jì)，回流冷凝管，攪拌器的 250 mL 三口燒瓶中加入甲苯 12 mL，對(duì)甲苯磺酸 g，月桂醇 0465 g 和對(duì)苯二酚 g，加熱到 60 ℃使其全部溶解，再加入上一步產(chǎn)物 B，升溫至設(shè)定反應(yīng)溫度 120 ℃，反應(yīng)時(shí)間為 4 h，待產(chǎn)物析出。 鹵化在物質(zhì) C（ mmol）的 DMF（20 mL）溶液中加入三苯基膦 PH3P( g, 7mmol)以及咪唑（ g, mmol）和碘 I2( g, mmol),混合物水浴加熱至 80 ℃并攪拌，反應(yīng)時(shí)間為 h,經(jīng)處理得產(chǎn)物（E） ，產(chǎn)物視性質(zhì)純化處理。表1 化學(xué)試劑名稱及規(guī)格序號(hào) 試劑名稱 規(guī)格 生產(chǎn)廠家1 蔗糖 分析純 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司2 原乙酸三甲酯 分析純 安徽安特生物化學(xué)有限公司3 叔丁胺 分析純 天津市褔晨化學(xué)試劑廠4 對(duì)甲苯磺酸 分析純 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所5 甲醇 分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠6 鹽酸 分析純 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司7 N,N二甲基甲酰胺 分析純 天津市天河化學(xué)試劑廠8 甲苯 分析純 東陵區(qū)精細(xì)化學(xué)廠9 2,2,4,6四甲基哌啶氧化物（ TEMPO）分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠10 溴化鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠11 次氯酸鈉 分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠12 月桂醇 分析純 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所13 對(duì)苯二酚 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠14 三苯基膦（PH 3P） 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司15 咪唑 分析純 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司16 碘 分析純 天津市永大化學(xué)試劑研發(fā)中心17 三甲胺 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司18 甲醇鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司19 冰醋酸 分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠20 氯仿 分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠 21 石油醚 分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文9 實(shí)驗(yàn)儀器本次實(shí)驗(yàn)所用的儀器設(shè)備如表 2 所示。圖 1 化合物 B1 的 TLC 圖通過質(zhì)譜和核磁，外加用標(biāo)準(zhǔn)品(來源于大連民族學(xué)院)通過 TLC 板比對(duì)，確認(rèn)產(chǎn)品A 為蔗糖6乙酸酯總結(jié)：試驗(yàn)結(jié)果與原設(shè)定步驟符合。量取 10 mL NaOCl 調(diào) pH 為 10。在此期間用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 維持在 10。用 4M HCL 調(diào)節(jié) pH 為 4。以丙酮：甲醇(1：4) 為展開劑,用薄層色譜法進(jìn)行跟蹤試驗(yàn) B1 的極性大于 A， 、并用質(zhì)譜與核磁確定其結(jié)果，經(jīng)譜圖解析，確認(rèn)產(chǎn)品 B1 為二羧酸，溶于水微溶于甲醇。量取10 mL NaOCl 調(diào) pH 為 10。在此期間用 NaOH 調(diào)節(jié) PH 維持在10。用 4M HCL 調(diào)節(jié) pH 為 4。以丙酮：甲醇(1：4) 為展開劑，用薄層色譜法進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下圖所示，確認(rèn)產(chǎn)品B2 為被氧化物且與 B1 為同一物質(zhì)，溶于水微溶于甲醇。量取 10 mL NaOCl 調(diào) pH 為 10。在此期間用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 維持在10。用 4M HCL 調(diào)節(jié) pH 為 4。以丙酮：甲醇(1：4) 為展開劑，用薄層色譜法進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下圖所示，確認(rèn)產(chǎn)品B3 不是要合成的目的產(chǎn)物。量取 28 mL NaOCl 調(diào) pH 為 10。在此期間用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 維持在 10。用 4M HCL 調(diào)節(jié) pH 為 4。以丙酮：甲醇(1：4) 為展開劑，用薄層色譜法進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下圖所示，確認(rèn)產(chǎn)品B4 比 B1 和 B2 的氧化程度高，溶于水微溶于甲醇。量取 60 mL NaOCl 調(diào) pH 為 10。在此期間用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 維持在 10。用 4M HCL 調(diào)節(jié) pH 為 4，30 ℃揮去溶液中水分，加入 30 mL 甲醇重結(jié)晶，得白色晶體，即為化合物 B5。圖 6 化合物 B5 的 TLC 圖總結(jié)：在考慮到生產(chǎn)成本問題可省去超聲，NaOCl 的用量 2 倍量即可，但溫度必須在 0 ℃條件下進(jìn)行。. 羧酸