【正文】 ............................24 正交試驗過程 ...........................................25 最佳條件的選擇 .........................................25結(jié) 論 .........................................................28參 考 文 獻 .....................................................29致 謝 .........................................................30蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文11. 緒 論 課題的目的和意義隨著生物化學與分子生物理論的不斷發(fā)展，基因治療已成為醫(yī)學界最活躍的研究領(lǐng)域之一。基因治療載體在基因治療過程中起一個轉(zhuǎn)運和保護的作用，是基因治療成功與否的關(guān)鍵。因此，基因治療載體的開發(fā)對基因治療的發(fā)展尤為重要，其有效開發(fā)將推動基因治療向常規(guī)治療方法的轉(zhuǎn)變 [1]。目前，用于臨床的基因載體大致分為病毒載體和非病毒載體兩類它們都具有各自鮮明的優(yōu)缺點，在臨床治療上亟需改進。脂質(zhì)體在所有已用于臨床試驗的基因載體中僅次于病毒載體，居第二位，是最有發(fā)展前景的非病毒載體。其中，陽離子脂質(zhì)體由于具有對陰離子型聚電解志敏感，對待負電荷的 DNA 有較高的轉(zhuǎn)運能力，還能轉(zhuǎn)運 RNA、核糖體及其他大電荷的分子和大分子物質(zhì)進入細胞等優(yōu)點，其轉(zhuǎn)染效率比其他脂質(zhì)體高出許多倍，因而被廣泛應用于基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中 [2]。陽離子類脂在作為基因載體和藥物傳遞等方面的應用越來越受到人們的關(guān)注。人們己研制出多種直接傳遞生物活性劑到活細胞內(nèi)的方法。其中包括被稱作“載體法” 的方法，此方法包括使用載體促進生物活性劑胞內(nèi)傳遞到特定靶細胞如疾病細胞內(nèi)。人們已研制出多種用于轉(zhuǎn)染生物活性劑的載體。例如，脂質(zhì)體和聚合物已被用于轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)，包括脫氧核糖核酸(DNA) 和核糖核酸 (RNA) [3]。然而，目前可用的載體(包括脂質(zhì)體和聚合物)對于生物活性物質(zhì)在體內(nèi)的胞內(nèi)傳遞一般是無效的。此外，目前可用載體在體外細胞轉(zhuǎn)染方面的應用也是有限的。然而，目前能得到的陽離子類脂和陽離子脂質(zhì)體對生物活性劑的體內(nèi)胞內(nèi)傳遞一般是無效的。此外，它們對于生物活性劑在血清內(nèi)的胞內(nèi)傳遞一般也是無效的。因為細胞需要血清來生存，所以這是一種嚴重缺陷。實質(zhì)上，在包含陽離子類脂和陽離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染研究過程中，通常需要從組織培養(yǎng)浴中移去血清。轉(zhuǎn)染后，補充血清。這樣必須包括附加操作步驟，從而使得陽離子類脂和陽離子脂質(zhì)體感染細胞變得復雜和麻煩。特別需要新的或更好的陽離子類脂用于胞內(nèi)傳遞生物活性劑 [4]。在如何獲得陽離子類脂方面，人們提出了許多合成方案，但還不甚完善，需要進一步探討和研究。本課題就是以蔗糖為原料通過酯化選擇性氧化再酯化，酯交換，鹵化等步驟來合成蔗糖酯類陽離子類脂的，本課題的目的就在于此。近年來，人們研制開發(fā)了陽離子類脂，如 N,Nˊ二（十二烷基氨基羰基亞甲基）N,N’二 (βN,N二甲基氨基乙基氨基碳基亞甲基)亞環(huán)己基1,4二胺(CDTALADMA) 和N,Nˊ 二( 十二烷氧基碳基亞甲基)N,N ˊ二(βN,N,N三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)乙二胺二碘化物。目前國外已經(jīng)有公司申請了相關(guān)的專利，并且就有關(guān)的陽離子類脂的合成給出了相應的方法，所以在前人的工作基礎(chǔ)上我們能相應的完成蔗糖酯類陽離子類脂的合成 [5]。就陽離子類脂的合成目前國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，還不能得到較高的產(chǎn)率，而且原料蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文2也不太容易獲得，而本課題采用蔗糖為原料來合成蔗糖酯類陽離子類脂，不僅原料易得而且也能獲得一個較好的收率。目前的生物活性劑體內(nèi)轉(zhuǎn)染細胞的方法一般是無效的，這樣阻礙了對治療各種疾病的改進方法的研究和使用。細胞膜為選擇性屏障，它能阻止物質(zhì)隨機進人細胞內(nèi)。因此，胞內(nèi)傳遞生物活性劑過程中最主要的困難被認為是如何將活性劑從胞外區(qū)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)區(qū)，同樣也難以將生物活性劑定位于選定細胞膜的表面 [6]。因此陽離子類脂在作為基因載體在基因治療方面必將具有廣闊的應用前景。因此探索一種合成簡單，無污染或少污染的新的陽離子類脂有著重要意義。 國內(nèi)外文獻綜述基因治療是現(xiàn)代癌癥治療的熱點，并且正在逐步變成現(xiàn)實?；蛑委煹闹饕康氖浅晒Φ膶⑦z傳物質(zhì)傳遞到目標組織、器官或者細胞。然而裸露的治療基因容易被核酸酶降解，表現(xiàn)出很差的細胞攝取效率。因此制備安全高效的基因載體就成為成功的基因治療的一個必要條件。病毒載體可以有效的轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)進入宿主細胞，但它們有很多不足，比如容易致突變，可能誘導免疫應答從而使得基因表達消失。因此人們越來越多的吧目光投向了非病毒載體。非病毒載體中的載體有一系列工藝優(yōu)勢，比如制備簡單，儲存穩(wěn)定，耐熱壓滅菌和冷凍干燥等等。陽離子載體由于可以靜電吸附基因，構(gòu)成穩(wěn)定的基因復合物而日益得到廣泛的研究。目前的研究主要集中在體外實驗，毒性仍然是這類載體應用于基因治療的主要障礙，而載體的毒性主要取決于制備過程中使用的陽離子類脂 [7]。陽離子類脂作為一種表面活性劑，由于其具有較好的生物活性所以其在基因治療方面得到廣泛的應用 1987 年，F(xiàn)elgner 和同事首次報道利用天然二醚聯(lián)陽離子脂質(zhì)（DOTMA）作為人類基因載體進入細胞進行基因治療。自那時以來，一些出版的報紙對用于基因傳遞的陽離子脂質(zhì)體的合成方案進行了報道，引起了社會的廣泛關(guān)注。近年來國內(nèi)外不斷有新的陽離子類脂的合成獲得成功，并取得相應的專利 [8]。目前，合成陽離子類脂的方法有很多，這主要是采用的原料不同從而得到的陽離子類脂的骨架不同的原因。近年來應用較多的是鹵化法獲得陽離子類脂。而蔗糖酯類陽離子類脂的合成目前國內(nèi)還沒有相關(guān)的報道，本課題應用蔗糖為原料進行蔗糖酯類陽離子類脂的合成，要經(jīng)過蔗糖三羧酸酯中間體的合成，然后再進行酯交換鹵化等步驟 [9]。 本文的主要研究內(nèi)容以蔗糖為原料酯化，得到蔗糖6乙酸酯，蔗糖6 乙酸酯再經(jīng)過選擇性氧化，再酯化得到蔗糖三羧酸酯，再經(jīng) 6 位羥基去保護生成 1ˊ,6ˊ蔗糖二酯再經(jīng)過 6 位羥基鹵化得到目的產(chǎn)物蔗糖酯類陽離子類脂。本文以 1’,6’蔗糖二酯鹵化得到目的產(chǎn)物作為重點討論蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文3部分，通過單因素實驗和正交試驗對實驗條件進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。 實驗研究內(nèi)容探索蔗糖酯類陽離子類脂中間體（鹵化）的合成研究（合成路線的設(shè)計、選擇、產(chǎn)品的提純） ；研究產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證方法；研究各因素對蔗糖酯類陽離子類脂的中間體鹵化的影響，設(shè)計單因素實驗和正交試驗；確認目標產(chǎn)物的收率為指標確定最佳條件 C6 羥基保護（蔗糖6乙酸酯的合成）的探索；蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文42 合成路線設(shè)計 初步設(shè)計鹵化反應的合成路線 通過中外文獻的檢索為發(fā)現(xiàn)相關(guān)蔗糖酯類陽離子類脂鹵化反應的文獻，再結(jié)合中外文獻的基礎(chǔ)上采用模擬推斷法自行設(shè)計了兩種方案如下： 初步設(shè)計以 DMF 為溶劑的 C6 位羥基選擇性鹵化反應酯化物（ mmol）的 DMF（60 mL）溶液中加入三苯基膦 PH3P( g, 23mmol)以及咪唑（ g, mmol）和碘 I2( g, mmol),混合物加熱至 80 ℃反應 h,產(chǎn)物視性質(zhì)純化處理。 OOHHO OHOOCORHOROCH I2P(h)3imidazoleDMF OIHO OHOOCORHOROCHE 初步設(shè)計吹 HCL 法的 C6 位羥基選擇性鹵化反應酯化物( mol)與三甲基氯硅烷 TMSCl( mol， g)混合液中加如 DMSO( mol, g),反應用 HCl 吹掃 1 分鐘，繼續(xù)攪拌反應 10 分鐘，產(chǎn)物視性質(zhì)純化處理。OOHHO OHOOCORHOROCH HCl(g)DMSO OClHO OHOOCORHOROCHETMSl蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文52 .2 初步設(shè)計合成實驗原理及步驟 初步設(shè)計合成實驗原理以蔗糖為原料酯化，得到蔗糖6乙酸酯，蔗糖6 乙酸酯再經(jīng)過選擇性氧化，再酯化得到蔗糖三羧酸酯，再經(jīng) 6 位羥基去保護生成 1’,6’蔗糖二酯再經(jīng)過 6 位羥基鹵化得到目標產(chǎn)物蔗糖酯類陽離子類脂，其合成過程如下所示。1 蔗糖6乙酸酯的合成 OOHHOOHOOHOHOHHCH3(OCH3)364S3 OOHOHOOHOHOHHOOCH3H3CO cyleopenig4Ac6Ac OAcHO OHOOHOHOHH 2 蔗糖6 乙酸酯的選擇性氧化 OAcHO OHOOHOHOHHONaOCl/NaBr/TEMPOH2pH 10 OAcHO OHOCONaOHNaOCHHCl OAcHO OHOCOHOHHOCHOAcHO OHOHOHOHHONaOCl/TEMPOH2pH 10OAcHO OHCONaOHNaOCHHClOAcHO OHCOHOHHOCH50Kz ultrasound B3 羧酸酯化蔗糖酯類陽離子類脂中間體合成研究（Ⅴ）論文64 羥基去保護 5 鹵化 初步設(shè)計試驗步驟 C6 羥基保護（蔗糖6乙酸酯的合成）干燥蔗糖（ g, mol，真空干燥箱中 60 ℃干燥 24 h）于三頸燒瓶中，加 50 mL DM