【正文】 （Aspergillus niger）、黑根霉（Rhizopus nigricans）。3. 儀器及用具蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。 四、操作步驟(—) 放線菌的形態(tài)觀察1. 觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈，然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，分別用低倍鏡、高倍鏡觀察, 找出3類菌絲及其分生孢子。 2. 水封片觀察 取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其分生孢子及基內(nèi)菌絲。 (2) ％美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻3 min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母的個體形態(tài)，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。 酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表示，以下式來計算： 2. 酵母菌液泡系的活體觀察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5 min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。 3．酵母的假菌絲的觀察 取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在濕室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖41)，28℃培養(yǎng)23d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察。 圖21 酵母菌假菌絲的培養(yǎng) 圖22 酵母菌的假菌絲形態(tài) A．藕節(jié)狀假菌絲 B. 竹節(jié)狀假菌絲(三) 霉菌觀察1．霉菌的形態(tài)觀察 采用濕室培養(yǎng)法培養(yǎng)霉菌。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛雷、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否有分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。 2．粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。 3．假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。 五、注意事項1．放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在培養(yǎng)操作中特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染。六、實驗報告l．繪制自然生長狀態(tài)下放線菌的形態(tài)。 3．繪制根霉、青霉、曲霉形態(tài)圖，標示各部分名稱?？捎脙煞N方法接菌：①先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種（接種量可適當擴大）。 (2) 插片及培養(yǎng)用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已經(jīng)接種平板以 45℃角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插入深度約占蓋玻片1/2的長度(圖43A)。 圖23 放線菌的插片和搭片示意圖A 插片法 B 搭片法2．搭片法(圖23B) (1) 開槽及接種用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個，并將棘孢小單孢菌孢子劃線接種至洞內(nèi)邊緣。 (二) 霉菌的培養(yǎng)1．霉菌的載片濕室培養(yǎng) （1）準備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一U形載玻片擱架，在擱架上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎．經(jīng)121℃濕熱滅菌30 min，置60℃烘箱中烘干，備用。接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。 （4）加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固之前, 用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁．否則不透氣。皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。 2．黑根霉假根的培養(yǎng)（圖24） 將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的1/2，冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種， 然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)23 d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)。2. 學習和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 （二）實驗內(nèi)容1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）的配制。 二、實驗原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖和代謝的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的多糖，是應(yīng)用最廣的凝固劑。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后使用。其原理是在密閉的高壓滅菌鍋中，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽，增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點提高，得到高于100℃的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性達到完全滅菌的目的。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時間要長（1～2 h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。三、 實驗材料和用具1. 試劑 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、K2HPO47H2O、FeSO42. 儀器及用具 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、稱量紙、試管架、棉花、牛皮紙、記號筆、皮筋、紗布、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過濾除菌器、培養(yǎng)皿塑料管（帶刻度）。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。塑料管將蓋子擰松后，用報紙包好。 (二) 培養(yǎng)基的配制 1. 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 （1）稱量 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中．需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。若偏堿，則用 1 mol/L HCl進行調(diào)節(jié)。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度. （4）過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。 （5）分裝 披實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。 分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜．滅菌后垂直待凝。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利透氣的作用。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布制成通氣塞。 （7）包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。如因特殊情況沒能及時滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫時保存。 （10）無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)2448 h, 無菌生長時可以使用，或放置在冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。其配方如下：可溶性淀粉2