【正文】 質(zhì)，按照分子大小電泳分離蛋白質(zhì)或其他分子混合物的一種技術(shù)。 雙向電泳：先按照等電點(diǎn)進(jìn)行等電聚焦電泳，然后在垂直方向按照分子大小再進(jìn)行 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)染色得到的電泳圖是二維分布的蛋白質(zhì)圖。 ?什么是凱氏定氮法？ 元素組成特點(diǎn)：由 CHONSPISe 等元素組成 :C（ 50~55%）、 H（ 6~8%）、 O（ 20~23%）、 N（ 15~18%）、 S（ 0~4%）、 ?；氮元素含量平均約 16%。它們在結(jié)構(gòu)上有什么共同特點(diǎn) ? 結(jié)構(gòu)上共同特點(diǎn)： Cα 結(jié)合（ NH3）（ Pro 除外）、（ COOH）、 H 原子和各種側(cè)鏈（ R）； Cα是不對稱 C，具有手性（ Gly除外），蛋白質(zhì)氨基酸都是 L型。 N末端分析： Sanger法、丹磺酰氯法（有很強(qiáng)熒光 ,靈敏度高）、 Edman法、氨肽酶法（外肽酶：肽鏈外切酶） C末端分析：羧肽酶法、與苯甲醛沉淀等。 還原法（含巰基 化合物使 S—S還原產(chǎn)生兩個(gè)半胱氨酸殘基（ CysSH） ,烷化劑（如碘乙酸）修飾 SH，阻止二硫鍵再生成）； 氧化法（過甲酸使 S—S氧化斷裂，生成半胱氨磺酸）。 酸水解法： 6mol/LHCl110℃ 加熱回流 16~24h,完全水解， Trp 被破壞， Gln,Asn酰胺基水解變成 Glu,Asp(Glx,Asx)近年來用甲基磺酸代替鹽酸。 ? 多肽鏈部分 斷裂，蛋白質(zhì)分解為小片段，肽段分離（至少兩套） 酶水解法：內(nèi)肽酶（肽鏈內(nèi)切酶） 胰蛋白酶法：水解 Lys或 Arg的羧基形成的肽鍵 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）法：水解 Phe、 Trp和 Tyr等疏水氨基酸的羧基形成的肽鍵 胃蛋白酶法：被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸如： PhePhe 化學(xué)法 ——CNBr法：裂解由 Met羧基形成的肽鍵。 結(jié)構(gòu)有幾種基本類型 ?各有何特點(diǎn) ? 基本類型： α螺旋； β折疊片層； β轉(zhuǎn)角；不規(guī)則卷曲 特點(diǎn)： α螺旋：右手螺旋， φ＝－ 57176。每個(gè)螺旋圈含 個(gè)氨基酸殘基，螺距 ，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn) 100176。 β折疊片層：肽鍵平面遇 Cα發(fā)生折疊 ,形成鋸齒狀結(jié)構(gòu)， R 側(cè)鏈交錯(cuò)位于折疊片的上面和下面，兩個(gè)殘基形成一個(gè)重復(fù)單位；兩條 或多條肽鏈片段順向平行（平行）或反向平行（反平行）排列，形成片層結(jié)構(gòu)；相鄰肽鏈上所有的羰基氧和氨基氫形成鏈間氫鍵。 ψ＝＋ 113176。 反平行 (Antiparallel)： φ＝－ 140176。；重復(fù)單位 。的回折形成發(fā)夾形狀；一般四個(gè)氨基酸組成，常見氨基酸： Pro,Gly,Asp,Asn,Trp；第 1個(gè)氨基酸殘基的 C=O與第 4個(gè)殘基的 NH之間形成氫鍵。 ? 特點(diǎn)：多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上高度折疊成緊密球形或橢球形結(jié)構(gòu)；大多數(shù)可離子化的親水的氨基酸殘基都位于分子表面（表面也含有疏水的氨基酸殘基），疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內(nèi)部（特別是一些疏水性強(qiáng)的氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸，通常水分子被排除在蛋白內(nèi)部）；三級結(jié)構(gòu)可將某些局部的二級結(jié)構(gòu)聚合在一起，形成特定的結(jié)構(gòu)區(qū)域，大多為口袋狀，核心多為疏水氨基酸，結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基常位于其中，多為蛋白質(zhì)的活性中心；穩(wěn)定維系三級結(jié) 構(gòu)的作用力有：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力、二硫鍵和配位鍵。 一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一級結(jié)構(gòu)不同 ,生物學(xué)功能各異：加壓素和催產(chǎn)素 一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，其功能也相同：同源蛋白 一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分變化 ,生物學(xué)活性改變或喪失： ACTH(39肽 ),切去 C 端 15個(gè)氨基酸仍有活性 ,但 N端 24個(gè)氨基酸切去一個(gè)就會影響活性； 一級結(jié)構(gòu)變化，生物學(xué)活性改變或喪失：疾病鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血 (Sicklecellanemia)Hbβ鏈 6位的 空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 酶原的激活：水解一個(gè)或幾個(gè)特定肽段致使酶分子構(gòu)象發(fā)生重塑 ——酶活性部位形成和暴露，表現(xiàn)出酶活性。 ? 組成和構(gòu)象特點(diǎn)： 原 膠原蛋白分子頭尾相連，交錯(cuò)排列，分子間共價(jià)交連，形成特征性帶狀纖維束。膠原鏈：每一圈螺旋含 3 個(gè)氨基酸殘基，每一個(gè)氨基酸殘基軸向距離為，螺距為 ；常重復(fù)出現(xiàn)三聯(lián)體序列 GlyProHyp。 ?變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)有哪些變化 ? 變性的因素：熱、紫外光、激烈的攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。 2）理化性質(zhì)改變： ① 分子形狀改變，肽鏈松散伸展，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被水解 ,易被酶消化。但若溶液 pH與蛋白質(zhì)的 pI差別較大 ,蛋白質(zhì)仍不易沉淀。 ?有什么生理意義 ? 可解離的基團(tuán)： N端氨基、 C端羧基、側(cè)鏈氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基、胍基等。 14制備生物大分子的基本步驟是什么 ? 基本步驟 ① 確定制備生物大分子的目的和要求（科研、開發(fā)、發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)）。整個(gè)分離純化過程的 ―眼睛 ‖ 制備生物大分子的關(guān)鍵。 ⑥ 生物大分子制備物的純度鑒定：要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或 HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。 ? 破碎細(xì)胞方法： ① 機(jī)械法：研磨、組織搗碎器 ② 物理法：反復(fù)凍融法、超聲波、壓 榨法、冷熱交替法 ③ 化學(xué)與生物化學(xué)方法：自溶法、溶脹法、酶解法、有機(jī)溶劑處理法。 防止蛋白酶或核酸酶的降解：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液 pH、離子強(qiáng)度或極性，使水解酶失活。 ?常用的有機(jī)溶劑有哪些 ? 難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿的蛋白質(zhì)和酶；既溶于稀酸、稀堿，又溶于含有一定比例有機(jī)溶劑的水溶液的蛋白質(zhì)和酶 常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。 以溶解度的差異為依據(jù)：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)：親和層析等 ，早期和晚期的分離純化方法有何不同 ? 分離純化流程中，早期和晚期分離純化方法的不同： ? 早期分離純化 :粗提取液（物質(zhì)成份復(fù)雜，物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多，目的產(chǎn)物濃度很?。?，所選方法要求快速、粗放；能較大地縮小體積；分辨力不必太高；負(fù)荷能力要大。吸附層析、 鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備 HPLC等。 蛋白質(zhì)和酶制成品： SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳（再用高效液相色譜（ HPLC）和毛細(xì)管電泳（ CE）進(jìn)行聯(lián)合鑒定則更為理想，必要時(shí)再做 N－末端氨基酸殘基的分析鑒定）。 核酸通常采用：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙 烯酰胺凝膠電泳，最方便是紫外吸收法。 溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，低溫抑制氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)和微生物。 光線：光化作用 ——受光催化發(fā)生變色、氧化和分解等；吸收光，分子活化不利于保存，紫外線能量大，對制品影響最大。 三．計(jì)算與推論題 計(jì)算 ① 谷氨酸、 ② 精氨酸、 ③ 丙氨酸的等電點(diǎn)。 ② 精氨酸和甲硫氨酸： pH7． 0精氨酸凈電荷＋ 甲硫氨酸凈電荷接近零，甲硫氨酸先洗脫。 ④ 甘氨酸和亮氨酸： pH7． 0 甘氨酸、亮氨酸凈電荷接近零，亮氨酸非極性大，甘氨酸先洗脫。 下面的數(shù)據(jù)是從一個(gè)八肽降解和分析得到的，其組成是： Ala、 Gly Lys、Met、 Ser、 Thr、 Tyr。用胰蛋白酶處理得到 ① Ala、 Gly； ② Gly、 Lys、 Met、 Ser、 Thr、Tyr。與DNFB反應(yīng)可產(chǎn)生 DNPGly。請確定該肽的氨基酸順序。 輔基：與酶蛋白以共價(jià)緊密結(jié)合 ,不容易被透析或超濾法除去，如黃素和生物素等。 誘導(dǎo)契合學(xué)說： 1958， Koshland，酶活性中心結(jié)構(gòu)是柔性的，當(dāng)?shù)孜铮せ顒┗蛞种苿┡c酶分子結(jié)合時(shí)，底物分子誘導(dǎo)酶蛋白構(gòu)象發(fā)生有利于與底物結(jié)合的變化，使反應(yīng)所需催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)正確排列和定向，轉(zhuǎn)入有效的作用位置，使酶與底物完全吻合，契合形成中間產(chǎn)物酶－底物復(fù)合物。 酶的最適 pH：表現(xiàn)出酶最大活性的 pH值。 酶的最適溫度：酶活性最高時(shí)的溫度 ,也即酶促反應(yīng)速度最大時(shí)的溫度。 不可逆抑制：與酶的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合 ,使酶喪失活性 ,不能用透析超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復(fù)活性。 可逆抑制：與酶以非共價(jià)鍵疏松結(jié)合使酶活性降低或喪失 ,能夠通過透析、超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復(fù)活性。 競爭性抑制作用：抑制劑結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競爭同一種酶的活性中心，從而影響 E與 S的結(jié)合，使酶活性降低。 非競爭性抑制作用：抑制劑與酶分子活性中心以外的其它部位結(jié)合而抑制酶活性， I和 S與酶結(jié)合不存在競爭關(guān)系。 反競爭性抑制作用：抑制劑（ I）僅與酶 —底物中間復(fù)合物（ ES）結(jié)合而抑制酶活性。 酶原：在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時(shí)無活性的酶的前體。 共價(jià)調(diào)節(jié)酶：能通過可逆共價(jià)修飾調(diào)節(jié)活性的酶。 寡聚酶：兩個(gè)或兩個(gè)以上亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合蛋白質(zhì)酶。 多酶復(fù)合體：功能相關(guān)，不同種類的酶非共價(jià)彼此鑲嵌形成的復(fù)合體 酶的回收率：（每次總活力 ∕第一次總活力） 100 酶的提純倍數(shù)： 每次比活力 ∕第一次比活力 比活力：每毫克蛋白所含有的酶活力單位數(shù)。 別構(gòu)效應(yīng)：變構(gòu)劑與酶的別構(gòu)部位結(jié)合，引起酶活性部位的構(gòu)象改變從而改變酶的活性。 區(qū)別：高效性：顯著降低化學(xué)反應(yīng)的活化能，提高反應(yīng)速度 10７ —101３倍（非酶催化劑）或 108—1