【正文】 解樣品，氨基酸自動分析儀測定。 酸水解法： 6mol/LHCl110℃ 加熱回流 16~24h,完全水解， Trp 被破壞， Gln,Asn酰胺基水解變成 Glu,Asp(Glx,Asx)近年來用甲基磺酸代替鹽酸。 堿水解法： 6mol/LNaOH煮沸 6h,完全水解，消旋， Ser、 Thr、 Arg、 Lys和 Cys破壞。 ? 多肽鏈部分 斷裂，蛋白質(zhì)分解為小片段，肽段分離（至少兩套） 酶水解法：內(nèi)肽酶（肽鏈內(nèi)切酶） 胰蛋白酶法：水解 Lys或 Arg的羧基形成的肽鍵 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）法：水解 Phe、 Trp和 Tyr等疏水氨基酸的羧基形成的肽鍵 胃蛋白酶法：被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸如： PhePhe 化學(xué)法 ——CNBr法：裂解由 Met羧基形成的肽鍵。 ? 測定每條小肽片段中的氨基酸排列順序（通常用 Edman降解法） ? 推斷蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序（重疊肽拼湊） ? 確定二硫鍵和酰胺基的位置。 結(jié)構(gòu)有幾種基本類型 ?各有何特點(diǎn) ? 基本類型： α螺旋； β折疊片層； β轉(zhuǎn)角；不規(guī)則卷曲 特點(diǎn)： α螺旋：右手螺旋， φ＝－ 57176。， ψ＝－ 47176。，每個螺旋圈含 個氨基酸殘基，螺距 ，每個殘基沿軸旋轉(zhuǎn) 100176。，上升 ；第 N個氨基酸殘基的羰基氧與第 N＋ 4個氨基酸殘基的氨基氫形成氫鍵，走向平行于螺旋軸； R側(cè)鏈基團(tuán)伸向螺旋的外側(cè)，其大小、形狀及電荷等影響此結(jié)構(gòu)形成。 β折疊片層：肽鍵平面遇 Cα發(fā)生折疊 ,形成鋸齒狀結(jié)構(gòu)， R 側(cè)鏈交錯位于折疊片的上面和下面，兩個殘基形成一個重復(fù)單位；兩條 或多條肽鏈片段順向平行（平行）或反向平行（反平行）排列，形成片層結(jié)構(gòu)；相鄰肽鏈上所有的羰基氧和氨基氫形成鏈間氫鍵。 平行 (Parallel)： φ＝－ 119176。， ψ＝＋ 113176。；重復(fù)單位 。 反平行 (Antiparallel)： φ＝－ 140176。， ψ＝＋ 135176。；重復(fù)單位 。 β轉(zhuǎn)角 :多肽鏈 180。的回折形成發(fā)夾形狀；一般四個氨基酸組成，常見氨基酸： Pro,Gly,Asp,Asn,Trp；第 1個氨基酸殘基的 C=O與第 4個殘基的 NH之間形成氫鍵。 不規(guī)則卷曲 (randomcoil)：沒有確定規(guī)律性的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。 ? 特點(diǎn)：多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上高度折疊成緊密球形或橢球形結(jié)構(gòu)；大多數(shù)可離子化的親水的氨基酸殘基都位于分子表面（表面也含有疏水的氨基酸殘基），疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內(nèi)部（特別是一些疏水性強(qiáng)的氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸，通常水分子被排除在蛋白內(nèi)部）；三級結(jié)構(gòu)可將某些局部的二級結(jié)構(gòu)聚合在一起，形成特定的結(jié)構(gòu)區(qū)域，大多為口袋狀，核心多為疏水氨基酸，結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基常位于其中，多為蛋白質(zhì)的活性中心；穩(wěn)定維系三級結(jié) 構(gòu)的作用力有：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力、二硫鍵和配位鍵。 ? 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力、二硫鍵 ? 一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu) ,空間結(jié)構(gòu)是功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，功能是空間結(jié)構(gòu)的外在表現(xiàn)，空間結(jié)構(gòu)尤其活性中心構(gòu)象變化，功能變化。 一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一級結(jié)構(gòu)不同 ,生物學(xué)功能各異：加壓素和催產(chǎn)素 一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，其功能也相同：同源蛋白 一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分變化 ,生物學(xué)活性改變或喪失： ACTH(39肽 ),切去 C 端 15個氨基酸仍有活性 ,但 N端 24個氨基酸切去一個就會影響活性； 一級結(jié)構(gòu)變化，生物學(xué)活性改變或喪失：疾病鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血 (Sicklecellanemia)Hbβ鏈 6位的 空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 酶原的激活：水解一個或幾個特定肽段致使酶分子構(gòu)象發(fā)生重塑 ——酶活性部位形成和暴露，表現(xiàn)出酶活性。 蛋白質(zhì)的別構(gòu)效應(yīng) (allosterism)：一個亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變。 ? 組成和構(gòu)象特點(diǎn)： 原 膠原蛋白分子頭尾相連，交錯排列，分子間共價交連，形成特征性帶狀纖維束。 原膠原蛋白： 3 條左手螺旋多肽鏈相互纏繞形成右手超螺旋分子，長 300nm，直徑為 ；靠鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持超螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。膠原鏈：每一圈螺旋含 3 個氨基酸殘基，每一個氨基酸殘基軸向距離為，螺距為 ；常重復(fù)出現(xiàn)三聯(lián)體序列 GlyProHyp。 ? 穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體系統(tǒng)的因素：分子表面的親水基團(tuán)與周圍水分子結(jié)合形成水化層 (水膜 )；分子表面的親水基團(tuán)可 結(jié)合或釋放 H+,帶一定電荷，水溶液中蛋白質(zhì)顆粒帶相同電荷。 ?變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)有哪些變化 ? 變性的因素：熱、紫外光、激烈的攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。 變性特征 : 1）生物活性喪失（主要標(biāo)志）。 2）理化性質(zhì)改變： ① 分子形狀改變，肽鏈松散伸展，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被水解 ,易被酶消化。 ② 蛋白質(zhì)變性后親水基團(tuán)被掩埋 ,溶解度降低、失去水膜，易形成沉淀析出 。但若溶液 pH與蛋白質(zhì)的 pI差別較大 ,蛋白質(zhì)仍不易沉淀。 ③ 球狀蛋白質(zhì)的不對稱性增加、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低 ,某些蛋白質(zhì)結(jié) 晶能力喪失。 ?有什么生理意義 ? 可解離的基團(tuán)： N端氨基、 C端羧基、側(cè)鏈氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基、胍基等。 ? 20種氨基酸 遠(yuǎn)紫外區(qū) (220nm)：均有光吸收 近紫外區(qū) (220300nm)：酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含共軛雙鍵苯環(huán)，在 280nm處有最大吸收峰。 14制備生物大分子的基本步驟是什么 ? 基本步驟 ① 確定制備生物大分子的目的和要求（科研、開發(fā)、發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)）。 ② 掌握目的產(chǎn)物的物理 化學(xué)性質(zhì)（文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)） ③ 建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法。整個分離純化過程的 ―眼睛 ‖ 制備生物大分子的關(guān)鍵。 ④ 生物大分子制備的前處理 生物材料的選擇細(xì)胞的破碎生物大分子的提取 ⑤ 生物大分子的分離純化 選擇和探索分離純化方案（最困難過程）。 ⑥ 生物大分子制備物的純度鑒定：要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，或 HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個峰。 ⑦ 產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。 ? 破碎細(xì)胞方法： ① 機(jī)械法：研磨、組織搗碎器 ② 物理法：反復(fù)凍融法、超聲波、壓 榨法、冷熱交替法 ③ 化學(xué)與生物化學(xué)方法：自溶法、溶脹法、酶解法、有機(jī)溶劑處理法。 ? 主要影響因素： 離子強(qiáng)度： ～ ～ ； pH值：避免過酸、過堿，一般 pH6～ 8，蛋白質(zhì)和酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，常偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)； 溫度： 0℃ ～ 5℃ ，溫度耐受力強(qiáng)的蛋白質(zhì)和酶，可提高溫度使雜蛋白變性。 防止蛋白酶或核酸酶的降解：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液 pH、離子強(qiáng)度或極性，使水解酶失活。 攪拌與氧化：溫和 攪拌，加入少量巰基乙醇或半胱氨酸防止巰基氧化。 ?常用的有機(jī)溶劑有哪些 ? 難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿的蛋白質(zhì)和酶；既溶于稀酸、稀堿，又溶于含有一定比例有機(jī)溶劑的水溶液的蛋白質(zhì)和酶 常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。 ? 分離生物大分子的方法： 以分子大小和形態(tài)差異為依據(jù)：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。 以溶解度的差異為依據(jù)：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 以電荷差異為依據(jù) ：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)：親和層析等 ，早期和晚期的分離純化方法有何不同 ? 分離純化流程中，早期和晚期分離純化方法的不同： ? 早期分離純化 :粗提取液（物質(zhì)成份復(fù)雜，物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多，目的產(chǎn)物濃度很稀），所選方法要求快速、粗放；能較大地縮小體積；分辨力不必太高；負(fù)荷能力要大。吸附、萃取、沉淀法（熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）、離子交換（批量吸附、胖柱交換）、親和層析等； ? 晚期分離純化 :細(xì)分級，分辨力高。吸附層析、 鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備 HPLC等。 ? 含量測定方法：凱氏定氮法、 Lowry法、紫外吸收法、染料結(jié)合法、膠體金法 純度鑒定方法：電泳、離心沉降、 HPLC和溶解度分析等。 蛋白質(zhì)和酶制成品： SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳（再用高效液相色譜（ HPLC）和毛細(xì)管電泳（ CE）進(jìn)行聯(lián)合鑒定則更為理想，必要時再做 N－末端氨基酸殘基的分析鑒定）。溶解度法和高速離心沉降法，現(xiàn)已很少再用。 核酸通常采用：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙 烯酰胺凝膠電泳，最方便是紫外吸收法。 ? 空氣：潮解、微生物污染和自動氧化。 溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，低溫抑制氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)和微生物。 水份：水參加水解、酶解、水合和加合，加速氧化、聚合、離解和霉變。 光線：光化作用 ——受光催化發(fā)生變色、氧化和分解等；吸收光，分子活化不利于保存，紫外線能量大，對制品影響最大。 pH：保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定 pH范圍 時間：生化和分子生物學(xué)樣品不可能永久存活。 三．計(jì)算與推論題