【正文】 凝膠緩沖液， 2ml 1%TEMED， ， 10%過硫酸銨混勻 →立即沿高板內(nèi)側(cè)倒凝膠液于兩板之間直至低板上沿 →插上梳子放置 15min，待膠凝后取下“ U”條 →重新將膠板放置于電泳槽內(nèi) →向外槽內(nèi)加三分之一槽深電極緩沖液 →向內(nèi)槽加入電極緩沖液沒過低板 →最后拔出梳子。 3. 加樣：用微量進樣器加入 7μl標(biāo)準(zhǔn)蛋白于中間膠槽內(nèi) →其余槽內(nèi)加入 7μl下列樣品①牛血清蛋白②綠豆分離蛋白 4. 電泳：連接電極線，高板外側(cè)接正極，低板內(nèi)側(cè)槽接負極，打開電源 →調(diào)電流120mA→電泳 2h（當(dāng)指示劑前沿超過二分之一膠長時停止） 5. 剝膠：取下膠板倒去電極緩沖液 →量取指示劑遷移距離和染色劑的前膠長，然后將膠板置于水龍頭下方?jīng)_玻板四周直至膠與玻璃板分離 6. 染色與固定：將膠板放入染色盒內(nèi) →向其中加入 %考馬斯亮藍 R250使其浸沒置于搖床上染色過夜 7. 脫色：用 10%乙酸溶液脫色至譜帶清晰，測定脫色后膠長及各譜帶遷移距離。 五 、 結(jié)果計算 計算相對遷移率： 以相對遷移率 MR為橫坐標(biāo)、 LgMr為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。 求分子量 距離距離脫色后膠長染色前膠長）（遷移 指示 劑 示 劑遷 移蛋白 質(zhì) 白 質(zhì)遷 移MR率相 對 ?? 五 、 注意事項 ? 1． 30%AcrBis是神經(jīng)毒化合物，操作時要小心，做好個人防護 ? 2．過硫酸銨需現(xiàn)用現(xiàn)配 ? 3．過硫酸銨和 TEMED在灌膠前加入即可 ? 4．用微量加樣器上樣時，勿刺破膠面 根據(jù)本實驗所學(xué)知識，自行設(shè)計豌豆凝集素的分離純化實驗。 六、思考題 實驗四 淀粉酶活力測定 一、實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握測定淀粉酶 （ 包括 α淀粉酶和 β淀粉酶 ） 活力的原理和方法 。 二、實驗原理 淀粉酶主要包括 α淀粉酶和 β淀粉酶兩種 。 α淀粉酶可作用于淀粉中的 α1,4糖苷鍵 ， 生成葡萄糖 、 麥芽糖 、 麥芽三糖 、 糊精等還原糖 ， β淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解 ， 生成麥芽糖 。 淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使 3,5二硝基水楊酸還原 ，生成棕紅色的 3氨基 5硝基水楊酸 。 其反應(yīng)如右圖 ： 淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于萌發(fā)后的禾谷類種子中，其中主要是 α淀粉酶和 β淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同， α淀粉酶不耐酸，在。 β淀粉酶不耐熱，在 70℃ 15min鈍化。根據(jù)它們的這種特性，采用加熱的方法鈍化 β淀粉酶，測出 α淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力（ α淀粉酶活力 +β淀粉酶活力），再減去 α淀粉酶的活力，就可求出 β淀粉酶的活力。 三、儀器和試劑 ? 主要儀器： ? （ 1）離心機 ? （ 2）分光光度計 ? 試劑 ? （ 1）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（ 2mg/mL） ? （ 2） 1%3,5二硝基水楊酸試劑 ? （ 3） 1%淀粉 四、操作步驟 以麥芽糖含量（ mg）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每 2組 4人做 1標(biāo)準(zhǔn)曲線） 編號 1(空白 ) 2 3 4 5 6 2mg/mL麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ mL） 0 蒸餾水（ mL） 0 1%3,5二硝基水楊酸（ mL） 2 2 2 2 2 2 沸水浴中準(zhǔn)確煮沸 5min后流水冷卻至室溫 蒸餾水（ mL） 16 16 16 16 16 16 A540 2. 淀粉酶液的制備： 在電子天平上稱取小麥芽（在 9428冰箱內(nèi)，用后放回） 加 20ml水研成漿狀 →轉(zhuǎn)移至離心管中 2022轉(zhuǎn) /分離心 5min（注意離心前對稱放置的離心管應(yīng)在天平上平衡） →取上清液于 100ml容量瓶中加水定容混勻 →即得淀粉酶原液 →用于 α淀粉酶活力測定 吸取原液 5ml于 100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀釋液 →用于總酶活力測定。 3. 淀粉酶活力測定 ① α淀粉酶活力測定 吸取原液 1ml于具塞試管中 →70℃ 保溫 15min用于鈍化 β淀粉酶 →加 1ml 1%淀粉置于 40℃ 水浴中保溫 5min→加 1% 2ml 沸水加熱 5min后加水至 20ml混勻測 A1（用 1管調(diào)零） ②總酶活力測定 吸取稀釋液 1ml于具塞試管中 →加 1ml 1%淀粉 40℃ 保存 5min→加入 1% 2ml沸水加熱 5min后加水至 20ml混勻測 A2（用 1管調(diào)零） 五、結(jié)果計算 β淀粉酶活力＝（ α＋ β）淀粉酶總活力－ α淀粉酶活力 麥芽糖含量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得 麥芽糖的毫克數(shù)原液體積為 100 稀釋倍數(shù)為 20 規(guī)定： 40度 5分鐘內(nèi)淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生 1mg麥芽糖為 1個活力單位（ u） 六、附 注 ? 1．樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。 ? 2．為了確保酶促反應(yīng)時間的準(zhǔn)確性，在進行保溫這一步驟時，可以將各試管每隔一定時間依次放入恒溫水浴，準(zhǔn)確記錄時間，到達5min時取出試管，立即加入 3,5二硝基水楊酸以終止酶反應(yīng)，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。同時恒溫水浴溫度變化應(yīng)不超過 177。 ℃ 。 ? 3．如果條件允許，各實驗小組可采用不同材料，例如萌發(fā) 1d、 2d、3d、 4d的小麥種子，比較測定結(jié)果，以了解萌發(fā)過程中這兩種淀粉酶活性的變化。 七、思考題 ? 1．為什么要將試管中的淀粉酶原液置 70℃ 水浴中保溫 15min？ ? 2．為什么要將各試管中的淀粉酶原液和 1%淀粉溶液分別置于 40℃ 水浴中保溫？ 實驗五 蛋白質(zhì)含量的測定 一、實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。 二、實驗原理 含氮的有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。 濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的過量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機酸滴定，直到恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)（相當(dāng)于待測物中氨的摩爾數(shù)）計算出待測物中的總氮量。 三、實驗試劑、器材 1．主要儀器 ? (1)凱氏定氮蒸餾裝置 ? (2)消化爐 ? (3)電子天平 2．試劑 ? (1)濃硫酸（化學(xué)純） ? (2)硫酸鉀 硫酸銅混合催化劑 ? (3)甲基紅 溴甲酚綠混合指劑 ? (4)2%硼酸溶液 ? (5)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液（約 ） ? (6)40%NaOH ? (7)四、操作步驟 ? 消化：在電子天平上稱取小麥粉 置于凱氏試管底部 →加混合混合催化劑 3ml濃硫酸置于消化爐中高溫加熱至淡綠色透明（ 2h左右）取出放入通風(fēng)櫥內(nèi)至不冒白煙，向其中加 20ml水，并移至 100ml容量瓶定容 →即得樣品消化液。 ? 同時每 4組 8人做 1空白實驗： +3ml濃硫酸置于凱氏試管中放入消化爐加熱至淡綠色（ 1h左右） →冷卻后加水移入 100ml容量瓶中定容得空白消化液。 ? 2. 蒸餾與吸收：吸取 10ml 2%的硼酸于三角瓶中 →加 4d甲基紅 溴甲酚綠混合指示劑（若變綠色則用 ）。將其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取 5ml消化液從漏斗上方加入蒸餾室內(nèi)用水洗兩次，并加入 10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗內(nèi)玻桿取下以防漏氣），然后打開通氣閥進行加熱蒸餾，直至吸收液由紫紅色變成綠色，計時蒸餾 3min→先移去吸收液再停止加熱以防倒吸。 ? 3. 滴定：用 ，記下耗去標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積 {}。 ? C：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度 ()。 ? V1：滴定樣品用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。 ? V0：滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平