【正文】 件很困難，特別是具有密切共生關(guān)系的生物及進(jìn)行寄生性營(yíng)養(yǎng)的生物；也有一些在理論上不可能進(jìn)行純粹培養(yǎng)的生物。誘變育種主要包括出發(fā)菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株 3個(gè)部分。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物的受精卵或胚胎中，使導(dǎo)入基因與受精卵染色體整合，并將外源基因穩(wěn)定地子代，使子代表現(xiàn)外源基因的性狀。 4 細(xì)胞破碎： 方法 原理 特點(diǎn) 機(jī)械法 勻漿法 基于液相的剪切力 適用面廣，處理量大，速度快，工業(yè)廣泛使用，不適 用某些高度分支微生物，產(chǎn)熱大，可能會(huì)生物活性物質(zhì)失活 珠磨法 研磨作用破碎 適用面廣，處理量大，工業(yè)廣泛使用，產(chǎn)熱大，可能會(huì)生物活性物質(zhì)失活 超聲波 超聲波的空穴作用破碎 產(chǎn)熱大，散熱不易，成本高，適用小量樣品破碎 物理法 干燥法 菌體細(xì)胞膜滲透性變化，自溶 較劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其他組分變性 凍融法 胞內(nèi)冰晶引起細(xì)胞膨脹破碎 較溫和，但破碎作用較弱，常需反復(fù)凍融，實(shí)驗(yàn)室使用 滲 透 壓沖擊法 滲透壓突然變化，細(xì)胞快速膨脹變化 較溫和，但破碎作用較弱，常與酶法合用 化學(xué)法 化 學(xué) 試劑處理 化學(xué) 試劑溶解細(xì)胞或抽提某些細(xì)胞成分 需選擇合適的試劑，減少對(duì)活性物質(zhì)的破壞，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn) 制 成 丙酮粉 丙酮迅速脫水，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的鍵 迅速脫水，減少蛋白質(zhì)變性，促進(jìn)某些結(jié)合酶釋放 生物法 酶解法 用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上特有的化學(xué)鍵 反應(yīng)條件溫和，但成本較高，一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用 組 織 自溶法 利用組織中酶改變、破壞細(xì)胞反應(yīng)條件溫和、成本低，不適用于易受酶降解的目的物的提取 結(jié)構(gòu)、使組織自溶 超聲波破碎細(xì)胞的原理： 超聲波的破碎作用與液體中空穴的形成有關(guān)。由于拉力的作用，出現(xiàn)細(xì)小的空穴。 術(shù)語(yǔ)： 凝聚作用：（ coagulation）是指在某些電解質(zhì)的作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥作用降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過(guò)程。 滲透壓沖擊法：把細(xì)胞放在高滲溶液中，由于滲透壓的作用，細(xì)胞外的水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂，使產(chǎn)物釋放到溶液中。 第四章 萃取法 溶液萃取法的基本 原理： 如某一抗生素在有機(jī)溶劑（不溶于水）中溶解度較大，當(dāng)料液與有機(jī)溶劑接觸后，抗生素就從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中。 溶液萃取法按操作方式不同，可分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取，后者分為錯(cuò)流萃取和逆流萃取。多級(jí)逆流與錯(cuò)流萃取相比，萃 取劑耗量較少，萃取液平均濃度較高。 （ 2）、界面電荷的影響： O/W 型乳狀液油滴多數(shù)是帶負(fù)電的， W/O 型乳狀液中水滴則帶正電。 （ 3）、介質(zhì)黏度：乳化劑能增加乳狀液的黏度，增加保護(hù)膜的機(jī)械強(qiáng)度，則形成的界面膜不易被破壞，并可阻止液珠的聚結(jié)。 雙節(jié)線：高聚物 P、 Q 的濃度均以重量百分含量表示，相圖右上部為兩相區(qū)，右下部為均相區(qū)，兩相與均相的分界線叫雙節(jié)線 多級(jí)錯(cuò)流萃?。毫弦航?jīng)萃取后的萃余液再用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取的方法。由于料液移動(dòng)的方向和萃取劑移動(dòng)的方向相反，故稱為逆流萃取。 超臨界流體萃?。海?supercritical fluid SCF）是利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質(zhì)溶解能力來(lái)進(jìn)行分離純化的技術(shù)。 基本原 理：一、鹽離子與蛋白質(zhì)表面具相反電性的離子基團(tuán)結(jié)合，形成離子對(duì)，因此鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用減弱而能相互結(jié)合。 影響鹽析效果的因素：（ 1）無(wú)機(jī)鹽的種類 （ 2）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）種類的影響 （ 3）蛋白質(zhì)濃度的影響 （ 4）溫度的影響 （ 5） pH 的影響 影響沉淀效果的因素：（ 1）有機(jī)溶劑種類及用量 （ 2） pH 的影響 （ 3）溫度 （ 4）無(wú)機(jī)鹽 的含量 （ 5）某些金屬離子的助沉淀作用 （ 6）樣品濃度 形成過(guò)飽和溶液的方法：（ 1）蒸發(fā)法 （ 2）溫度誘導(dǎo)法 （ 3）鹽析結(jié)晶法 （ 4）透析結(jié)晶法 （ 5）有機(jī)溶劑結(jié)晶法 （ 6）等電點(diǎn)法 （ 7）微量擴(kuò)散法 （ 8）化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 （ 9）共沸蒸餾結(jié)晶 影響晶體大小的因素：（ 1）過(guò)飽和度 ：增加過(guò)飽和度能使成核速度和晶體生長(zhǎng)速度加快，對(duì)前者影響較大，過(guò)飽和度增加，晶體較細(xì)小。（ 3）攪拌速度：攪拌能促進(jìn)成核和加快擴(kuò)散， 提高晶核長(zhǎng)大的速度，過(guò)快則晶體會(huì)被打碎。（ 4）晶種 加入晶種能誘導(dǎo)結(jié)晶，還能控制晶體的形狀、大小和均勻度。等電點(diǎn)沉淀法操作簡(jiǎn)便，試劑消耗少，給體系引入的外來(lái)物質(zhì)少，常用的純化方法，主要適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)。 0 除去堿性雜蛋白，調(diào) pH3。 7 術(shù)語(yǔ) Ks 鹽析：在一定的 pH 和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析。 鹽析分布曲線：蛋白質(zhì)沉淀的速度可用 — dS/dP 對(duì)鹽飽和度（ P）作圖表示。 透析結(jié)晶法：為了使蛋白質(zhì)溶解度的變化緩慢而且連續(xù)，而進(jìn)行透析的方法；在鹽濃度緩慢降低的結(jié)晶情況下，進(jìn)行透析。在吸附劑和吸附物之間有電子的轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)鍵，這種吸附稱為化學(xué)吸附。物理吸附與吸附劑的表面積、孔分布和溫度等因素有密切的關(guān)系。 項(xiàng)目 物理吸附 化學(xué)吸附 作用力 范德華 庫(kù)侖力 吸附力 較小，接近液化熱 較大，接近反應(yīng)熱 選擇性 幾 乎沒(méi)有 有選擇性 吸附速度 較快，需要活化能很小 慢，需要較高的活化能 吸附分子層 單分子層或多分子層 單分子層 吸附劑及被吸附物的極性對(duì)吸附的影響： 一般極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。如活性炭從水中吸附有機(jī)化合物；硅膠是極性的，適宜從有機(jī)溶劑中吸附極性物質(zhì)。由于雜質(zhì)存在，濃度升高后，吸附的雜質(zhì)量也上升 ，吸附選擇性差。吸附量是指單位重量吸附劑所吸附物質(zhì)的量。 活性炭：吸附能力很強(qiáng)的非極性吸附劑。除雜，生化藥物的分離。帶正電荷。 磷酸鈣凝膠：吸附作用主要是鈣離子與蛋白質(zhì)負(fù)電基團(tuán)結(jié)合。白陶土能吸附分子量較大的雜質(zhì)，包括導(dǎo)致過(guò)敏的物質(zhì)，常用它脫色。 大網(wǎng)格高聚物吸附劑與傳統(tǒng)吸附劑相比的優(yōu)點(diǎn)： 選擇性好、解吸容易，理化性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度好，反復(fù)使用，流體吸力較小。 負(fù)吸附：去除提取液中的雜質(zhì)。 第七章 凝膠層析 公式 Ve=Vo+KdVi 各字母的含義，凝膠層析的原理。這里所謂的平衡是指擴(kuò)散的平衡，即溶質(zhì)分子擴(kuò)散進(jìn)入一個(gè)填料顆?？字星以俪鰜?lái)所需要的時(shí)間遠(yuǎn)小于溶質(zhì)區(qū)段在此停留的時(shí)間。平衡條件只是在流速很慢時(shí)一個(gè)極端情況。 名稱 特點(diǎn) 用途 葡 聚 糖 凝 膠（ Sephadex G） 最常用，穩(wěn)定，對(duì)陽(yáng)離子輕微吸附，多次重復(fù)使用 分離 修飾葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 化學(xué)穩(wěn)定好，成分不易脫落，適用 pH 廣，機(jī)械強(qiáng)度好，無(wú)帶電基團(tuán)，分辨率較高 瓊脂糖類凝膠 多孔玻璃微球 化學(xué)穩(wěn)定性高、強(qiáng)度大、高壓下操作，好的流速；缺點(diǎn)是對(duì)糖類、葡萄糖吸附 疏水性凝膠 只適用分離分子量較小的物質(zhì) 分離不溶水的有機(jī)物質(zhì) 選擇凝膠：選擇何種凝膠及其型號(hào)、粒度，一方面是考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離分子量范圍，（滲入限與排阻限），理化穩(wěn)定性、強(qiáng)度、非特異吸附性質(zhì) 等；另一方面還要注意分離目的和樣品的性質(zhì)。 選柱：層析柱的有效體積與柱比的選擇必須根據(jù)樣品的數(shù)量、性質(zhì)及分離目的加以確定。底端支持物滿足兩個(gè)條件：不易阻塞，死腔小。要求不漏不堵，不吸附樣品，且能保持一定的流速。開(kāi)始裝柱時(shí)， 避免膠粒直接沖擊支持物，空柱種應(yīng)約留1/5的水或溶劑。為了防止柱中出現(xiàn)氣泡，凝膠懸液溫度必須與室溫平衡并用水泵減壓排氣。 溶質(zhì)通過(guò)色譜峰時(shí)造成的峰加寬效應(yīng)包括： （ 1）分子擴(kuò)散：使用顆粒度小而均勻的填料可以降低擾動(dòng)作用。應(yīng)用小而均勻的填料緊密地裝在內(nèi)徑適當(dāng)?shù)闹锌梢詼p少由渦流擴(kuò)散造成的峰加寬，提高效柱。擴(kuò)散速度越快，流速不平衡的影響就越小。填充介質(zhì)粒度越小所造成的峰加寬效應(yīng)也小。 測(cè)定的依據(jù)是不同分子量的物質(zhì)，只要在凝膠的分離范圍內(nèi)（滲透限與排阻限之間），洗脫體積 Ve 及分配系數(shù) Kd 值隨分子量增加而下降。（ 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 以多個(gè)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過(guò)柱，測(cè)取各自的 Ve 值。在同一測(cè)定體系中測(cè)取未知物質(zhì)的 Ve，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量。外水體積：凝膠柱床中凝膠顆粒之間的液相體積。分級(jí)分離：分開(kāi)分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。全滲入： Kd=1 全排阻： Kd=0 分離限 ..分辨率： R=△Ve/(1/2(Wa +Wb))分辨率與洗脫體積的差值成正比，而與兩物質(zhì)的洗脫峰寬度成反比。 （ 2） 用高濃度的同性離子根據(jù)質(zhì)量作用定律將目的物離子取代下來(lái)。舉兩種樹(shù)脂骨架。各種樹(shù)脂除注明類別和編號(hào)外，還需標(biāo)明載體的交聯(lián)度。強(qiáng)酸 1X7，交聯(lián)度為 7%。 偶極離子的交換特點(diǎn)：凈電荷為零時(shí)，正電中心和負(fù)電中心并不重疊，遂成偶極。偶極離子的排斥作用，所以使樹(shù)脂對(duì)氨基酸的吸附量大大降低。 偶極離子的排斥力隨氨基酸的 R 基碳鏈的加長(zhǎng)而減弱。 大孔、均孔樹(shù)脂的特點(diǎn)：大孔型離子交換樹(shù)脂的特征： 1 載體骨架交聯(lián)度高，有較好的化學(xué)和物理穩(wěn)定性及機(jī)械強(qiáng)度。 3表面積大，表面吸附能力強(qiáng)，對(duì)大分子物質(zhì)的交換容量大 4 孔隙率大，比重大，對(duì)小離子的體積交