【正文】 胰島素原折疊成三維結構，并形成二硫物，再經工具酶切開，除去 C肽。 反轉錄酶法：通過胰島素原的 cDNA 合成人胰島素。 以生物組織為原料提取純化多肽和蛋白質，在選擇材料及選擇分離純化方法時注意點： 材料選擇： （ 1） 種屬 （ 2）發(fā)育生長階段 （ 3）生物狀態(tài) （ 4）原料來源 （ 5）原料解剖血部位 分離純化方法： 1 根據蛋白質等電點的不同來純化蛋白質 2 根據蛋白質分子形狀和大小的不同來純化蛋白質 3 根據蛋白質溶解度的不同來純化蛋白質 4根據蛋白質電離性質的不同來純化蛋白質 5根據蛋白質功能專一性的不同來純化蛋白質 6 根據蛋白質疏水基團與相應的載體基團結合來純化蛋白質 7 根據 蛋白質在溶劑系統(tǒng)種分配的不同來純化蛋白質 8根據蛋白質的選擇性吸附性質來純化蛋白質 9根據蛋白質的某些特殊性質進行純化 純化注意點： （ 1） 分離純化早期使用方法的選擇 2 各種分離純化方法的使用順序3 分離純化后期的保護性措施 4 對分離純化每一步驟的優(yōu)劣進行綜合評價 酸醇提取法 以胰臟為原料生產胰島素的工藝 工藝流程： ~ 倍的 86%~88%乙醇（ W/W）和 5%草酸提取→用~ 濃氨水堿化，用硫酸酸化 ~→減壓濃縮，蒸去乙醇→去脂、 27%（ W/V）固體氯化鈉鹽析→精制→除酸性蛋白質→鋅沉淀→ 結晶→回收 重組 DNA 技術制造人胰島素的兩途徑。 常見的 氨基酸輸液的類型： （ 1） 氨基酸營養(yǎng)輸液（ 2）代血漿用輸液 （ 3）止血用氨基酸輸液 （ 4）嬰幼兒用氨基酸輸液（ 5）治療用氨基酸輸液 多肽類藥物及蛋白質類藥的分類。必需氨基酸（ E）與非必需氨基酸（ N）之比一般在 1：1 或 1： 3 之間。 組方的原理和原則： （ 1）所供氨基酸除質量要合格外，尚需根據組合原理確定氨基酸的比例及組成。 簡述用酶轉化法由反丁烯二酸生產天冬氨酸，丙氨酸的過程和所用的關鍵酶。 （ 3） 酶轉化法：反應大多在水溶液中進行，條件溫和、選擇性高、副產物少、生產工藝簡單，分離精制容易。水解、分離、結晶。 （ 4）生物藥物制劑的特殊要求。（ 2）生物活性物質組成結構復雜、穩(wěn)定性差。（ 4）生理副作用常用發(fā)生。 (主要資源：（ 1）氨基酸類藥物 （ 2）多肽與蛋白質類 （ 3）核酸類藥物 （ 4）酶類藥物 （ 5）糖類藥物 （ 6）脂類藥物 （ 7）維生素及輔酶類 藥理學特性：（ 1）藥理活性高 （ 2）治療的針對性強，治療的生理、生化機制合理，療效可靠。00t ttk R ??? 選擇因子：表示柱對難分離物質的選擇性的好壞。 速率理論：在低流速時增加流速，峰變銳，柱效增加；當超過一定流速時峰變鈍，柱效降低。 （ 3） 樣品和流動相同時加在第一個塔板上，且 樣品垂直于前進方向的擴散（縱向擴散）可以忽略。在柱內每層塔板內部，組成能夠在流動相和固定相中達到平衡。 蛋白質分離的依據：蛋白質的疏水性、分子的大小、等電點。 當膜面出現第一個氣泡，記下壓力計讀數，將此壓力換算成 dyn/cm2 ,進行計算。氣泡壓力法：在多孔板上加 3~5mm深的水或 其他液體。水流量法：將濾膜以蒸餾水完全潤濕，裝于濾器中，下接抽氣瓶。濃度極化現象：超濾在外壓作用下進行。 7 術語 超濾：以特殊的超濾膜為分離介質，以膜兩側的壓力差為 推動力，將不同分子量的物質進行選擇性分離。 優(yōu)點：沒有相轉移，無需舔加任何強烈化學物質，可以在低溫下操作，過濾速度較快，便于做無菌處理等。 超濾技術是一項分子級薄膜分離手段。 t—— 時間， s。 G—— 干濕膜重量差， g。 S—— 膜的厚度， mm。 計算孔徑： r= GPtVSK水 (其中 r—— 濾膜孔隙半徑， cm。 實驗用超濾器的類型： （ 1） 無攪拌式裝置 （ 2）攪拌或振動 式裝置 （ 3）小棒超濾器 （ 4）淺道系統(tǒng)超濾裝置 膜孔徑檢測技術： （ 1）氣泡壓力法 D=4Kσ cosθ /P 修正為： D=4 σ /P （ 2）水流量法：將濾膜以蒸餾水完全潤濕，裝于濾器中，下接抽氣瓶。此外，將某種水解酶類固定于膜上，能降解造成極化現象的大分子，提高流速。包括一定的強度和柔韌度，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重復使用。 不具 有與溶質、溶劑起作用的基團。由于介質一般為水，所以膜材料應具有親水性，它只允許小分子溶質通過。當移動至其密度與介質密度相等的位置便不再移動，形成靜止區(qū)帶，即達到離心平衡。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。 差分離心：差 速離心。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。 差分離心的特點、用途。（ 2）介質的密度需嚴格掌握：梯度最大值≤組分最小密度（ 3）樣品的密度 梯度密度最小值 (4)分離依據是各組分之沉降系 數差（ 5）分辨率受組分沉降系數、離心時間、顆粒擴散系數、介質黏度及梯度范圍和形狀的影響。 速度區(qū)帶離心的特點及其用途：離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分通過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達到其等密度區(qū)之前即停止離心。 （ 6）細胞洗 脫轉子：低速離心時連續(xù)分離型轉子，最高轉速不超過6000r/min。結構簡單，低速時加樣，高速時排出清夜。顆粒沉降時間短，可用于差速、密度梯度及等密度離心，用于平衡等密度離心時效果最佳。 （ 4）垂直管轉子：特殊類型的定角轉子。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。對流作用小，“壁效應”弱。 （ 1）角度轉子：機械強度高，重心低，運轉平穩(wěn)，壽命長，管內溫度分布均勻，溫差對流小，離心時間短，使用方便，但離心管外壁易產生強烈對流和渦流，同時管外側會出現沉淀，形成壁效應。用符號“ g” 或 “ g” 表 示。 親和反膠團萃?。菏侵冈诜茨z團相中除通常的表面活性劑（如 AOT）外，舔加另一種親水頭部為目標分子的親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標分子的親和結合作用，促進目標產物在反膠團相的分配，提高目標產物的分配系數和反膠團萃取分離的選擇性。 親和錯流過濾： (affinity cross flow filtration)ACFF 將親和層析與超濾技術結合，高分子底物經專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過 濾的優(yōu)點。金屬螯合層析：利用金屬離子的絡合或形成螯合物的能力吸附蛋白質的分離系統(tǒng)。正洗 脫：吸附提取物中的有效成分。配基：在親和層析中起可逆結合的特異性物質。 9 術語： 親和力：配基對互補分子間的作用力，是制備高效親和柱的重要參數。 （ 20壓降小，流速快，設備體積小，配基用量低。 親和膜分離原理及特點：親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。 親和層析中的非專一性吸附有以下情況：（ 1）離子情況 （ 2）疏水基團 a 長的烴類結構的“手臂” b 疏水性配基 （ 3）復合親和力 確定離子強度以獲得良好的分離效果 親和層析洗脫方法：（ 1）非專一性洗脫 改變洗脫劑的 pH 以影響電性基團的解離程度而洗脫（ 2）特殊洗脫 （ 3）專一性洗脫 競爭性效應 非競爭性效應 反競爭性效應 二次作用親和沉淀 :利用在物理場（如 pH、離子強度、溫度和舔加金屬離子等）改變時溶解度下降，發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和 沉淀介質。微環(huán)境的影響，包括載體及手臂的電性、極性、次級鍵對配基親和力的影響。配基與載體的結合位點的影響。為了將親和配體和其他物質分開，在實際親和層析時，通常需要阻流值≥ 10。 制作高親和力的親和吸附劑 :提高親和層析效果，固定相的配基和流動相的配基具有較強的親和力。 由于酶的活性中心常是埋藏在其結構的內部，它們與介質的空間障礙影響其與親和配 基的結合作用。 選擇配基的注意點：（ 1）配基與配體由足夠大的親和力（ 2）配基與配體的結合應是專一的（ 3）配基應具有化學活性。對設備要求不高，操作簡便，使用范圍廣，特異性強，分離速度快，分離效果好，分離條件溫和。 利用生物體中多數大分子物質具有與某些相應的分子專一型可逆結合的特性。 蛇籠樹脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型陰離子交換樹脂中聚合而成的一類樹脂。 PBE94：多緩沖交換劑 尼柯爾斯方程： m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c11/z1 / c21/z2..交換容量： meq/g(毫克當量 /克樹脂 ) 樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理過程。 大孔型強酸型離子交換樹脂 大孔型弱酸型離子交換樹脂 大孔型弱堿型離子交換樹脂 甲基磺酸纖維素 乙基磺酸纖維素 二 乙基氨基乙基纖維素 芐基化的 DEAE纖維素 術語： CMC：羧甲基纖維素。所有的樣品必須在第一個樣品峰尚未被洗脫前加入。加上相同的第二個樣品，它將以洗脫液移動的速度下降，直到追到正在慢移的第一個樣品成分處（聚焦）。 （ 2）蛋白質的色譜行為：蛋白質所帶電荷取決與他們的等電點和介質的 的 pH 低于它的等電點時，蛋白質帶正電荷，它不與陰離子交換劑結合，隨洗脫液向下移動。堿性蛋白質（等電點約 pH8）作為一個陽離子，用羧甲基纖維素層析可在 pH3.~。 0之間進行，蛋白質和交換劑都是解離的，帶有相反的電荷。 酸性蛋白質（等電點約 pH5），作為一個陰離子，它的 DEAE纖維素柱層析可在 pH5。升高環(huán)境的 pH或是降低環(huán)境的 pH 或增加離子強度都能將被吸附物質洗脫下來。 離子交換纖維素為開放