【正文】 (親子鑒定 )上的應(yīng)用 ,基因融合等 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR技術(shù)檢驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn) (1).準(zhǔn)確 每種致病菌的引物和特異基因都是該試劑公司經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究和并反復(fù)試驗(yàn)準(zhǔn)確無(wú)誤的，尤其是拿到了國(guó)際或國(guó)家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的公司。一次可檢測(cè) 96— 384個(gè)樣品（大型 PCR檢測(cè)的樣品還可以更多）。 (3).容易造成樣品間的交叉污染 由于普通 PCR的檢驗(yàn)是在一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)中進(jìn)行的，所以容易形成樣品間的交叉污染。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（ RealTime PCR）的出現(xiàn)有效地解決了上述的問(wèn)題，并成為了現(xiàn)在醫(yī)院檢測(cè)傳染性疾?。ǜ窝?，性病，細(xì)菌感染）的首先。 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR 概論 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)于 1996年由美國(guó) Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決 PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。 定量 PCR儀是在普通 PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置， PCR擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測(cè)，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)： 利用 熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化 ， 通過(guò) Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì) 起始模板 進(jìn)行定量分析 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR常用的三個(gè)常用概念 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、 Ct值 (1).擴(kuò)增曲線：反映 PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強(qiáng)度的曲線，定量 PCR儀每次輪 PCR擴(kuò)增都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng) 度的變化 熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光檢測(cè)元件擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)： 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（ C y c l e ）； 縱坐標(biāo)： 熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)： 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（ ）； 縱坐標(biāo)： 熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR常用的三個(gè)常用概念 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、 Ct值 (2).熒光閾值： 樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值， 手動(dòng) 設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值 和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸 系數(shù)大于 。 C(t) value (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR所用的熒光報(bào)告基團(tuán) (1).非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green (2).特異性熒光標(biāo)記： TaqMan探針 Molecular Beacon分子信標(biāo) (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的特性 (1).SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈 DNA的小溝部位 (2).SYBR Green 只有和雙鏈 DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 (3).變性時(shí)， DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光 (4).復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈 DNA,SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： (1).對(duì) DNA模板沒(méi)有選擇性 適用于任何 DNA (2).使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 (3).非常靈敏 (4).便宜 缺點(diǎn)： (1).容易與非特異性雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性 但可以通過(guò) 融解曲線 的分析 ，優(yōu)化反應(yīng)條件 (2).對(duì)引物特異性要求較高 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 6. TaqMan水解型雜交探針 與目標(biāo)序列互補(bǔ) TaqMan探針的特性： (1).5′ 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán) (Reporter, R) ，如 FAM、 VIC等 (2).3′ 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) (3).探針完整， R所發(fā)射的熒光能量被 Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與 Q分 開(kāi)，發(fā)熒光 (4).Taq酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探針 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 6. TaqMan水解型雜交探針工作原理 每擴(kuò)增一條 DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 (1).極高的特異性和準(zhǔn)確性 由于探針?lè)ǔ艘镄蛄械奶禺愋灾?，還有探針序列的特異性，從 兩個(gè)方面保證了所 擴(kuò)增基因的特異性。 但是目前市售熒光定量 PCR試劑盒采用的都是 TaqMan探針?lè)ā? (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR的數(shù)學(xué)原理 理想的 PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的 PCR反應(yīng)： X=X0* (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR的數(shù)學(xué)原理 在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí) : XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量 . 在閾值線設(shè)定以后 ,它是一個(gè)常數(shù) ,我們?cè)O(shè)為 M 方程式 (1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得 : log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式 (2)得 : log X0= log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值 就可計(jì)算出樣品中所含的模板量 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR的數(shù)學(xué)原理 模板 DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR的數(shù)學(xué)原理 25 Sample 確定未知樣品的 C(t)值 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的 C(t)值推算出其初始量 (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 BAX系統(tǒng) 國(guó)際上唯一一家被 AOAC認(rèn)證的 RealTime PCR食品微生物檢測(cè)系統(tǒng) (五 ).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 ?上世紀(jì) 90年代中頁(yè)，從杜邦中心研發(fā)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展出來(lái) Outgrowth of