【正文】 etrifilmTM自動(dòng)判讀儀來計(jì)數(shù)。培養(yǎng) 圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù) 。結(jié)果報(bào)告n 1) 選取菌落數(shù)在 15~150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 。n 7) 最終菌落濃度的單位以 “cfu/g (mL)”表示。BPWn 選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)繁殖，其它細(xì)菌受到抑制 。沙門氏菌的分類學(xué)地位n 歸于腸桿菌科沙門氏菌屬n 下設(shè) 6個(gè)亞屬： I、 II、 IV、 V、 VI及 III（原亞利桑那菌屬）n 常見的種：雞沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌n 形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，有動(dòng)力，短小桿菌。沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟n 沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟是：n 增菌培養(yǎng)n 接種鑒別培養(yǎng)基，分離菌落n 生化試驗(yàn)，鑒定到屬和種；也可以用噬菌體試驗(yàn)鑒定到屬n 血清學(xué)分型增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)n 首先是增菌培養(yǎng)基的靈敏度。n 過去的理解是 25克食品中不能檢出沙門氏菌，但是沒有提出要測(cè)定增菌液的靈敏度。含有 5~10個(gè)細(xì)菌的標(biāo)本內(nèi)獲得陽(yáng)性結(jié)果。增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)n 國(guó)際上常用的沙門氏菌增菌培養(yǎng)基有 3種，即： (1)亞硒酸鹽增菌液或亞硒酸鹽胱氨酸增菌液， (2)四硫磺酸鹽增菌液或四硫磺酸鹽孔雀綠增菌液， (3)氯化鎂孔雀綠增菌液。沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別 1n 沙門氏菌是賴氨酸陽(yáng)性、氰化鉀和 酶陰性的；而弗勞地氏檸檬酸桿菌群則是賴氨酸陰性、氰化鉀和 。在弗勞地氏檸檬酸桿菌群里，氰化鉀和尿素酶也不是 100%陽(yáng)性，而且也偶爾出現(xiàn)賴氨酸陽(yáng)性的菌株。生化鑒別試驗(yàn)生化鑒別試驗(yàn)n 根據(jù)以上所述，可將以上五項(xiàng)生化試驗(yàn)編制成一份腸桿菌科常見屬、種生化試驗(yàn)簡(jiǎn)化診斷表。腸桿菌科常見細(xì)菌簡(jiǎn)化診斷表腸桿菌科常見細(xì)菌簡(jiǎn)化診斷表序號(hào) 硫化氫 靛基質(zhì) 賴氨酸 氰化鉀 尿素酶 判 定 結(jié) 果 () A1 + + 沙門氏菌屬 A2 + + + 沙門氏菌屬，緩慢愛德華氏菌A3 + + +97 94 弗氏檸檬酸菌群，奇異變形菌A4 + + + + 普通變形菌B1 +/ 大腸埃希氏菌，沙門氏菌屬， 志賀氏菌屬B2 + +/ 大腸埃希氏菌，志賀氏菌屬B3 +/ + /+ 克雷伯氏菌族 (注 )B4 + +/ + 普羅菲登斯菌屬，摩根氏菌屬 注：包括克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷氏菌屬，另做補(bǔ)充試驗(yàn)鑒定。特別是美國(guó)學(xué)者法默 （Farmer, III）于 1986年提出了包括腸桿菌科細(xì)菌近 100個(gè)種的 47項(xiàng)生化特性。微生物分析儀微生物分析儀n 微生物分析儀是細(xì)菌分類鑒定的工具。按理，商家應(yīng)當(dāng)向雇主提供《細(xì)菌鑒定編碼表》，該表的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)與細(xì)菌的生化特性表一致。n 不過，由于生產(chǎn)工藝和試驗(yàn)條件的限制，有幾項(xiàng)重要的生化試驗(yàn)項(xiàng)目未能列入微生物分析儀中。補(bǔ)充生化試驗(yàn)補(bǔ)充生化試驗(yàn)n 試驗(yàn)者對(duì)于所獲得的生化試驗(yàn)結(jié)果有懷疑時(shí)，可用手工方法進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，直至認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可信為止。沙門氏菌的血清學(xué)分型就是按照這些抗原的成分進(jìn)行分型。再按照 H抗原分型。血清學(xué)分型的注意事項(xiàng)血清學(xué)分型的注意事項(xiàng)n 標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株做血清型鑒定的時(shí)候，往往比較順利，新分離的菌株做血清分型往往不順利。應(yīng)當(dāng)不要用灼熱的接種環(huán)去挑取血清。可以接種在半固體瓊脂上，促使 H抗原的發(fā)育。驗(yàn)證菌株鑒定的結(jié)果驗(yàn)證菌株鑒定的結(jié)果n 沙門氏菌的鑒定結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有完整的血清學(xué)分型結(jié)果。n 只 H有在屬和種的鑒定結(jié)果是完全可靠的情況下，才能做出沙門氏菌未定型的鑒定結(jié)論。1℃ 18～ 24h n 陽(yáng)性 報(bào)告n CTSMAC平板和改良 CHROMagar O157顯色瓊脂平板n 36177。1℃ 18～ 24h n 陽(yáng)性 陰性n ↓ ↓n 非 O157菌　　　血清學(xué)試驗(yàn)n 　　　　　　　　 ↓n 　　　　　　　生化試驗(yàn)n　　　　　 ↓n 　　　　報(bào)　告操作步驟操作步驟n 1 增菌 以無菌操作取檢樣 25g(mL)加入到含有 225mL mEC+n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì) 1～ 2　 min。1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h。2 .分離n 取增菌后或篩選試驗(yàn)陽(yáng)性的 mEC+n肉湯，分別劃線或適當(dāng)稀釋后取 CTSMAC平板和改良 CHROMagar O157顯色瓊脂平板上，于 36177。必要時(shí)將混合菌落分純。在改良 CHROMagar O157顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色 紫紅色，邊緣無色或淺灰色。n 劃線時(shí)應(yīng)多次往返，保證分離效果。n 注意區(qū)分典型菌落，必要時(shí)分純。3. 初步生化試驗(yàn)n 在 CTSMAC和改良 CHROMagar O157顯色瓊脂平板上挑取 5～ 10個(gè)典型或可疑菌落，分別接種 TSI瓊脂，同時(shí)接種 MUGLST肉湯，于36177。 必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。置 LSTMUG肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)無熒光產(chǎn)生，陰性對(duì)照應(yīng)有熒光；對(duì)分解乳糖且無熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純，于 36177。n 血清學(xué)試驗(yàn)n 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或 O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。對(duì)于 H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂管，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代 3次，動(dòng)力試驗(yàn)陰性， H7因子血清凝集陰性者，確定為無動(dòng)力株。n 生化試驗(yàn)n 用 API20E或 VITEKGNI+或其它腸桿菌科生化鑒定試劑盒，按照生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行。n 菌液的稀釋應(yīng)注意無菌操作，濁度應(yīng)達(dá)到使用說明的要求。n 2. 磁珠分離：n 將 Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用 1只 Eppendorff管，然后插入到磁板架上。n 磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，避免產(chǎn)生泡沫。 取取 mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物肉湯增菌培養(yǎng)物 1mL，加入到，加入到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩 10s。每個(gè)樣品更換樣品更換 1只加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行只加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染，避免交叉污染n 取樣前混勻，避開脂肪層與雜質(zhì)，必要時(shí)使用濾網(wǎng)。 加樣后立即混勻。加樣后立即混勻。 結(jié)合：在 18～ 30℃ 環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在適合的裝置上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng) 10min，使 O157與免疫磁珠充分接觸。 結(jié)合時(shí)不要將磁鐵插入到磁板架中。保證磁珠與 O157的結(jié)合。在 3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中和蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時(shí)，在 Eppendorff管壁中間明顯可見的圓形或橢圓形棕色聚物。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠積聚物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。每個(gè)樣品換用 1支加長(zhǎng)吸管。在吸取上清液時(shí)，很難做到不丟失磁珠，在這種情況下，可保留 50～ 100μL上清液于Eppendorff管中。n ：從磁板架上移走磁板，在每個(gè)Eppendorff中加入 1mL PBSTween20洗液，轉(zhuǎn)動(dòng)磁板架 3次以上，洗滌免疫磁珠混合物。n 重復(fù)上述步驟 2. 4～ 2. 5 n 洗滌共 3次，動(dòng)作要輕柔。上清液的吸取應(yīng)盡量完全。 免疫磁珠懸浮：移走磁板，將免疫磁珠重新懸浮在 100μL PBSTween20洗液中。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于 36177。注意，若 CTSMAC平板和改良CH