基因探針ppt課件-在線瀏覽
2025-02-25 00:27本頁(yè)面
【正文】 核酸雜交技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。 一、基因探針 1） DNA酶切片段 2）用 PCR 擴(kuò)增出的核酸 3）直接用 RNA作探針 4）人工合成（含標(biāo)記） 1. 基因探針的類型 2. 基因探針的要求 1）盡量避免高度重復(fù)序列：根據(jù)目的而定。 2） G+C含量： 4060% 3）探針本身不能有 4個(gè)連續(xù)互補(bǔ)堿基，否則本身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（兼并性） 6）探針比模板短：實(shí)際用長(zhǎng)探針檢測(cè)短模板的也可，不影響結(jié)果。 2）硝酸纖維膜 (NC膜 )：吸附單鏈 DNA、 RNA能力強(qiáng)， 80100 ug/cm2；也可非特異性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。 3）尼龍膜：吸附 DNA能力比 NC膜強(qiáng)，也可吸附小至 10bp的 DNA。 4）化學(xué)活化膜：用化學(xué)試劑把 NC膜處理，可吸附極少量核酸。 5）濾紙 核酸雜交常用幾種膜的性能比較 硝酸纖維膜 (NC膜 ) ? 硝酸纖維膜有兩種 。商品化地高辛標(biāo)記 dCTP，即合成鏈時(shí)，用地高辛標(biāo)記 dCTP。 ②生物素 親和素：用酶標(biāo)親和素測(cè) dCTP生物素 ③熒光：送生物公司標(biāo)記 5. 探針標(biāo)記方法 1） DNA的切口平移 2）隨機(jī)引物法 3）單鏈 DNA探針 4） RNA探針 5） DNA的 5’ 或 3’ 末端標(biāo)記 6）寡核苷酸標(biāo)記 7） PCR標(biāo)記 DNA的切口平移法 雙鏈 DNA分子的一條鏈有切口時(shí)，大腸桿菌 DNA聚合酶 I可把核苷酸殘基加到切口處的 3’ 羥基端。 5’ 端核苷酸的去除與 3’ 端核苷酸的加入同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著 DNA鏈移動(dòng) (切口平移 )。如果寡核苷酸的序列不均一，它們就會(huì)在模板的許多位臵上和模板雜交，因此模板上的每個(gè)核苷酸 (可能要除去最靠近 5’ 端的一些核苷酸 )被拷貝進(jìn)產(chǎn)物中去的頻率相同。 隨機(jī)引物的獲得 ： 1）用 DNA酶 I消化小牛胸腺 DNA或鮭精 DNA 產(chǎn)生大量6— 12 核苷酸的單鏈 DNA。如 Pharmacia、 Boehringer、 Mannheim等。 單鏈 DNA探針 單鏈探針僅由特定核酸序列的互補(bǔ)雙鏈之一組成，與傳統(tǒng)的雙鏈探針相比有很大的優(yōu)越性。當(dāng)用來(lái)自某一種生物中的探針去檢測(cè)另一種遠(yuǎn)緣生物中可與之交叉雜交的序列時(shí)，單鏈探針尤為有用。 將靶序列克隆于適當(dāng)?shù)?M13噬菌體或噬菌粒載體中，分離出帶有靶序列的單鏈 DNA 通用引物 利用通用引物合成與靶序列 互補(bǔ)的放射性標(biāo)記 DNA 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段 3種未標(biāo)記 dNTP 1 種 32p標(biāo)記 dNTP 用切點(diǎn)位于靶序列遠(yuǎn)端的限制酶來(lái)消化 DNA 通過(guò)凝膠電泳把標(biāo)記探針與未標(biāo)記的的模板分開(kāi) 放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)參照物 未標(biāo)記的模板 DNA 放射性標(biāo)記的 DNA 來(lái)自標(biāo)記DNA 3’ 端的片段 利用單鏈 DNA載體合成探針 (從左到右 ) RNA探針 在來(lái)自鼠傷寒桿菌 SP6噬菌體或來(lái)自大腸桿菌 T7及 T3噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子下游裝臵多克隆位點(diǎn)，組建成質(zhì)粒載體，可合成高比活度的單鏈 RNA探針。因?yàn)橛糜诤铣?RNA的模板可被轉(zhuǎn)錄多次，所以產(chǎn)生的 RNA數(shù)倍于模板。 3）僅用無(wú) RNA酶的 DNA酶 I處理就可從 RNA探針中除去模板 DNA。 4）由于 RNA雜交體的穩(wěn)定性本身就比較高，所以 RNA雜交反應(yīng)中產(chǎn)生的信號(hào)一般要比相同比活度的 DNA探針強(qiáng)?？捎?RNA酶 A來(lái)消化 RNA∶ RNA雜交體，而不必用難以控制的 S1核酸酶來(lái)消化 DNA∶ RNA雜合分子。 ②大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段：用大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段合成與合成寡核苷酸互補(bǔ)的 DNA鏈，可得到高比活度的探針。該引物隨后在大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段的作用下延伸，從而使 [α32p]dNTP在模板指導(dǎo)下發(fā)生摻入。g/ml變性小牛胸腺 DNA或鮭精 DNA . ? 50% 甲酰胺 ? 洗滌 液 2XSSC, %SDS 5min. ? 2XSSC, % X SDS 15 min.(室溫 ). ? , % X SDS 37 176。 C洗滌 30min至1h.( 水浴 ) ? 顯影 (放射性 ,非放射性 )
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