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2025-06-29 03:38本頁面
【正文】 編碼序列。 ?Host anism/cell: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning. ?Hosts for DNA cloning vector Prokaryotic host : E. coli ( most cases) Eukaryotic host : Yeast (Saccharomyces cerevisiae), large fragments of human genome Host cell 宿主細胞 Vector（載體） 在基因工程操作中，把能攜帶外源 DNA進入受體細胞的 DNA分子叫載體。具有 RNA轉(zhuǎn)錄所需的啟動子和終止子。 整合是通過質(zhì)粒與受體細胞中同源序列間發(fā)生的同源重組介導(dǎo)的。） ?是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀 DNA分子。 ?生物學(xué)特征： （ 1）分子量?。?2～ 200kb，多個拷貝。 ③ 線形 DNA （ linear ， lDNA） （ 5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： scDNA最快、 L DNA次之、 ocDNA最慢。 ?質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理 ampr基因編碼 β－ 內(nèi)酰胺酶 ，降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素。 Kanr 編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 ，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。 該技術(shù)高效、快捷、特異性好。 ? 1988年，美國 PEcetus公司推出世界上第一臺 PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動化； ? 1993年， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎； ? 1995年，定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實。端， Taq DNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的 DNA雙鏈 原理： 在試管中，利用 DNA聚合酶、一對引物和四種dNTP，對模板 DNA反復(fù)多次地進行復(fù)制，從而得到大量擴增產(chǎn)物的反應(yīng)過程。 N次循環(huán)后，得到 2n條 DNA PCR的基本反應(yīng)步驟 制備模板 DNA PCR循環(huán)反應(yīng) PCR產(chǎn)物的檢測 （ 1）電泳分離 PCR產(chǎn)物 （ 2）染色及檢測 樣本來源：各種組織細胞、培養(yǎng)細胞、寄生蟲、微生物、臨床標(biāo)本、犯罪現(xiàn)場標(biāo)本、考古標(biāo)本。 如何提取自己的 DNA? ?在懸浮緩沖液中 重懸細胞 ； ?溶菌酶 降解細菌細胞壁； ?裂解緩沖液中裂解細胞 ，裂解緩沖液含有 SDS和NaOH, SDS的作用是破碎細胞膜及引起蛋白質(zhì)變性。 ?中和 ：中和緩沖液含 KOAc (pH 5)， 其作用是沉淀已變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA及大部分去污劑。 ? 堿裂解 染色體線性 DNA和或有缺口的質(zhì)粒 DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) —SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。 在堿性條件（ pH8）下有活性。 ③ EDTA Mg2+、 Ca 2+的螯合劑，可抑制 DNA酶的活性，防止 DNA被酶降解。 SDS: 溶解細胞膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成 “ 蛋白 —SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括 DNA酶）變性沉淀。 用來中和 NaOH變性液，使 DNA復(fù)性。 ⑥ 酚 氯仿 蛋白變性劑，進一步抽提 DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化 DNA)。 DNA分子以水合狀態(tài) “ 溶于 ” 水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 ?其發(fā)現(xiàn)及鑒定是實現(xiàn) DNA克隆的關(guān)鍵。 ?識別序列： 4～ 8 bp的回文序列； ?特異性高 ： ?酶切產(chǎn)物： 3’或 5’突出末端或平頭末端 。 Gel Electrophoresis ① 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率 ② 電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 ④ 摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān) : 分子量越大，移動越慢。 ?瓊脂糖凝膠 瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體 “ 胨 ” 。 濃度高 空隙小 ?瓊脂糖凝膠的分辨力 Agrose: a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution (%3%) 核酸在凝膠中向正極移動？ 核酸具有很強的負電性 。 ?EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置 . ?熒光強度與 DNA含量及大小成正比。 Ligase： 由 ATP水解提供能量，將 dsDNA切口處 5’－磷酸與 3’－ 羥基相結(jié)合 DNA ligation Transformation ?感受態(tài)細胞 (ponent cell)：用 Ca2+ 溶液處理后易于吸收外源 DNA的大腸桿菌細胞 。 ?轉(zhuǎn)化：感受態(tài)細胞吸收外源 DNA（ 質(zhì)粒）的過程。 轉(zhuǎn)化率的變動幅度從粗放轉(zhuǎn)化程序 103/μg ~ 精細轉(zhuǎn)化程序 108/μg。誘導(dǎo)與 DNA修復(fù)有關(guān)的酶及其它細胞成分的生成。 selection Distinguish between the recreated vector and religated vector is very important. 鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒是分子克隆中非常重要的步驟。 ? lacZ編
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