[自然科學(xué)]分子克隆-在線瀏覽
2024-12-06 03:34本頁面
【正文】 胞方法得到的組分可以直接用于下一步實驗。 ? 室溫下加入 50μLMgCl2/CaCl2溶液并輕輕混勻。 ? 加入 75μL終止液終止反應(yīng)。 ? 把液相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用兩倍體積的乙醇沉淀核酸。煮 3min使 DNA變性。 ? 電泳結(jié)束后，將膠真空干燥一個小時，然后用X射線膠片曝光，需在 20度曝光幾小時。 ? 優(yōu)化方案： 在反應(yīng)混合物中單價陽離子濃度要小于 200mmol/L,通常是在 50mmol/L范圍內(nèi)。 DNA酶 Ⅰ 足跡分析的緩沖環(huán)境是由核提取物中的組分提供的，所以必要時可以改變緩沖環(huán)境中的離子成分 。 為了觀察到足跡所需的蛋白抽提物的量要取決于該蛋白與 DNA的親和力。 DNA酶 Ⅰ 的量在實驗過程中是比較重要的，確切的濃度要依靠試驗本身來確定。 一個對照反應(yīng)不含核提取物，可以鑒別裸 DNA片段中能夠抵抗 DNA酶 Ⅰ 的下滑或只被部分消化的區(qū)域；另一個不在第二步中加入 DNA酶 Ⅰ ，這樣可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的內(nèi)切核酸酶。只要在 DNA結(jié)合蛋白保護的序列里有一處以上發(fā)生了酶切，就可以推斷該蛋白是有兩部分組成的。 ? 這種方法很直接，化學(xué)試劑在本質(zhì)上對所有的磷酸二酯鍵作同等切割，而且這些試劑對大多數(shù)緩沖液成分不起反應(yīng)，本方法有時能夠提供關(guān)于識別序列中蛋白質(zhì)和個別核苷酸相對親和力的詳細信息。 DNA結(jié)合蛋白的凝膠阻滯分析 ? 概述 ? 實驗原理 ? 實驗方法（ EMSA） 概述 ? 凝膠阻滯試驗是分析 DNA結(jié)合蛋白的方法，本方法現(xiàn)在通常用于監(jiān)測 DNA(或 RNA)結(jié)合蛋白的純化 。建立反應(yīng)常數(shù) (如親和結(jié)合常數(shù)和開 /關(guān)速率 )，以及研究蛋白一蛋白組裝或多種蛋白在基因序列上的相互作用 ? 20世紀 70年代 凝膠阻滯最初是 hahlberg等和 Shaup等作為分析核糖體蛋白和核糖體 RNA相互作用的技術(shù)。 ? 當發(fā)現(xiàn)非標記載體 DNA抑制蛋白和放射性標記靶 DNA的非特異結(jié)合后，凝膠阻滯才用于研究哺乳動物細胞粗裂解物等復(fù)雜混合物中序列特異的 DNA結(jié)合蛋白。但是，這種方法到目前為止仍然主要 用于研究和分析反式作用蛋白和順式 DNA序列形成的調(diào)控真核和原核生物基因表達的復(fù)合物。 ? DNA 蛋白復(fù)合物或 RNA蛋白復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針根據(jù)研究的結(jié)合蛋白的不同，可以是雙鏈或者是單鏈。在檢測 RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的 RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。DNA結(jié)合蛋白后形成的復(fù)合物帶有了蛋白質(zhì)的電泳遷移特性。發(fā)生鎖定現(xiàn)象使有利于復(fù)合物的形成，所以甚至非常弱的結(jié)合作用也都能觀測到。 ? 競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的 DNA或 RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定 DNA或 RNA結(jié)合蛋白的特異性。 ? 試驗反應(yīng)體系中加入放射性標記探針的同時加入過量的非
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