[自然科學(xué)]分子克隆(編輯修改稿)
2024-11-15 03:34 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 核苷酸相對(duì)親和力的詳細(xì)信息。 ? 除此以外，傳統(tǒng)的 DNA酶 Ⅰ 足跡法程序復(fù)雜，并且要求目的蛋白經(jīng)過(guò)一定程序的純化，而固相DNA酶 Ⅰ 足跡法通過(guò)結(jié)合有模板的磁珠，先富集序列特異的 DNA結(jié)合蛋白，進(jìn)行 DNA酶 Ⅰ 酶切，然后用測(cè)序膠分離并分析結(jié)果。 DNA結(jié)合蛋白的凝膠阻滯分析 ? 概述 ? 實(shí)驗(yàn)原理 ? 實(shí)驗(yàn)方法（ EMSA） 概述 ? 凝膠阻滯試驗(yàn)是分析 DNA結(jié)合蛋白的方法，本方法現(xiàn)在通常用于監(jiān)測(cè) DNA(或 RNA)結(jié)合蛋白的純化 。確定一種已知或可能的 DNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的序列 。建立反應(yīng)常數(shù) (如親和結(jié)合常數(shù)和開(kāi) /關(guān)速率 )，以及研究蛋白一蛋白組裝或多種蛋白在基因序列上的相互作用 ? 20世紀(jì) 70年代 凝膠阻滯最初是 hahlberg等和 Shaup等作為分析核糖體蛋白和核糖體 RNA相互作用的技術(shù)。 ? 20世紀(jì) 80年代，用純化了的原核調(diào)控蛋白與其 DNA靶序列進(jìn)行結(jié)合平衡和動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究。 ? 當(dāng)發(fā)現(xiàn)非標(biāo)記載體 DNA抑制蛋白和放射性標(biāo)記靶 DNA的非特異結(jié)合后，凝膠阻滯才用于研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞粗裂解物等復(fù)雜混合物中序列特異的 DNA結(jié)合蛋白。 ? 序列特異的 DNA結(jié)合蛋白這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在已擴(kuò)展到用于分析蛋白和異常構(gòu)象的 DNA形成的復(fù)合物，包括 Holliday連接、錯(cuò)配堿基對(duì)和 ZDNA。但是，這種方法到目前為止仍然主要 用于研究和分析反式作用蛋白和順式 DNA序列形成的調(diào)控真核和原核生物基因表達(dá)的復(fù)合物。 原理 ? 通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和 32P同位素標(biāo)記的 DNA或 RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，利用了電泳遷移率的差異分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。 ? DNA 蛋白復(fù)合物或 RNA蛋白復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。凝膠像無(wú)水的籠子，阻止游離的組分向溶液中擴(kuò)散這種籠子效應(yīng)可以維持局部組分的高濃度，有效地驅(qū)使雙分子重結(jié)合反應(yīng)的平衡向右。同位素標(biāo)記的探針根據(jù)研究的結(jié)合蛋白的不同，可以是雙鏈或者是單鏈。 ? 當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的 DNA結(jié)合蛋白，可用 純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液 。在檢測(cè) RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的 RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。 ? 通常 DNA片段用 32 P進(jìn)行放射性標(biāo)記，而蛋白質(zhì)不標(biāo)記。DNA結(jié)合蛋白后形成的復(fù)合物帶有了蛋白質(zhì)的電泳遷移特性。因?yàn)榭梢允褂酶弑然钚缘?DNA探針以及聚丙烯酰胺凝膠中有 “ 鎖定 ” 現(xiàn)象發(fā)生，所以本方法非常靈敏。發(fā)生鎖定現(xiàn)象使有利于復(fù)合物的形成，所以甚至非常弱的結(jié)合作用也都能觀測(cè)到。 ? DNA結(jié)合反應(yīng)的蛋白特異性可以用競(jìng)爭(zhēng)性分析實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)。 ? 競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的 DNA或 RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來(lái)確定 DNA或 RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1