【正文】 因致病的分子機制（突變位點或表達變化）已知目 目 錄目 錄目 錄目 chips）n 蛋白質(zhì)芯片 (protein錄目 錄DNA序列測定原理 (雙脫氧末端終止法)目 sequencing）目 錄（五） Ⅰ 限制性內(nèi)切酶位點的變化目 錄目 設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在 PCR擴增后用該限制酶切割 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。錄目 可借助核酸分子雜交或 PCR進行檢測。由于 DNARFLP）length錄 （四）限制性片段長度多態(tài)性分析 （ restrictionPCRSSCP分析 －目 錄目 錄PCRSSCP分析原理示意目 的突變造成 DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。SSCP）錄（三） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（ singlestrandPCRASON：正常基因； H：雜合子基因； M：突變基因ASO1 ASO2NHM目 錄目 3.錄目 錄目 錄2.錄目 錄目 Mg2+reaction,錄目 錄（二） 聚合酶鏈式反應(yīng) (polymerase錄目 先將捕捉探針吸附于固相支持物上，與靶基因序列 A部分雜交，再加入標記的檢測探針，檢測探針與靶基因序列 B部分雜交，檢測雜交信號。固相夾心雜交法(sandwich錄目 目 withFISH）n 掛鎖 FISHin situ錄5. 原位分子雜交n 熒光原位雜交ASO）目 specific等位基因特異性寡核苷酸錄目 改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率 。blotting）反向斑點雜交（ reverse錄目 斑點雜交（ dot錄目 Northern印跡雜交 (NorthernRNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測特定的 mRNA分子的含量與大小。錄blotting)目 Southern → 變性處理 → DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合 → 將標記的探針與膜上 DNA片段雜交，分析雜交信號。錄錄核酸分子雜交流程 待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號核酸探針制備探針標記加入標記探針目 目 acid錄目 n 免疫組織化學(xué)診斷 n Western 免疫印跡（ Westernn 生物芯片（ biochips） sequencing） n 限制性片段長度多態(tài)性（ RFLP） n 聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)acid錄目 早期診斷性252。 高特異性252。目 目 錄一、 基因 診 斷的概念、特點及 臨 床意義 定義： 利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法。目 Kan錄目 錄基因診斷之父 — 簡悅威錄目 錄F 第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)F 第二節(jié) 遺傳病的基因診斷F 第三節(jié) 傳染病的基因診斷F 第四節(jié) 腫瘤的基因診斷F 第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 F 第六節(jié) 基因治療的概念及策略 本章內(nèi)容提要目 目 錄 基因診斷與基因治療Gene Diagnosis and Gene Therapy第二十八章目 錄目 錄第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)Basis of Gene Diagnostics目 1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家 YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例 α地中海貧血進行診斷。錄目 基因診斷檢測的目標分子是 DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。錄目 錄診斷依據(jù) (遺傳物質(zhì)改變 )l DNA、 RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高；l 基因結(jié)構(gòu)變化，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。錄目 錄基因診斷的特點252。 高靈敏性252。 應(yīng)用廣泛性目 錄二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)n 核酸分子雜交（ Nucleichybridization） n 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ SSCP） n DNA序列測定（ DNAblotting ） 目 錄（一）核酸分子雜交 Nucleichybridization 指兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離子和有機溶劑濃度）下，按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。錄目 錄目 提取 DNA→ 限制性內(nèi)切酶消化 DNA以產(chǎn)生特定長度的片段 → 凝膠電泳分離 1.印跡雜交 (Southern錄目 2.blotting)目 錄3.blotting）將 RNA或 DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究。錄目 4.dot先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品 RNA或 DNA標記變性后進行雜交。目 錄寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對正常和突變ASO探針進行反向斑點雜交，檢測點突變， 大大提高檢測結(jié)果的可靠性。(alleleoligonucleotide,錄目 (fluorescencehybridization,(FISHpadlock)錄目 錄熒光原位雜交（ FISH）目 錄6.hybridization)待測靶基因序列上兩個相鄰但不重疊的 DNA片段（ A、 B片段），分別作為捕捉探針（不標記的 A片段）和檢測探針（標記的 B片段），同時與靶基因雜交。目 錄固相夾心雜交法示意圖 目 chainPCR）模板引物dNTPTaq DNA聚合酶變性延伸 退火目 錄PCR在基因診斷中的應(yīng)用n RTPCRn 熒光定量 PCRn 多重 PCRn PCRASOn ASPCRn PCRSSCPn PCRRFLP目 錄1.RTPCR目 熒光定量 PCR熒光標記引物目 錄多重 PCR 多重 PCR示意圖 A：普通 PCR； B：多重 PCR目 錄4.錄目 conformationpolymorphism,DNA目 錄目 錄正常人 純合突變 雜合突變+錄目 fragmentpolymorphism,變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段。目 錄PCRRFLP目 錄A B C D E F G－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－ ＋C +DAEcoR錄目 DNA序列測定（ DNA錄目 錄目 錄左側(cè)：正常；右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究目 錄（六）生物芯片 （ biochips）n 基因芯片（ genechip)目 錄基因芯片雜交流程示意圖目 錄基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法 優(yōu)點與問題 解決方案核酸分子雜交 結(jié)果可靠但操作繁瑣 選擇合適的探針 PCR 靈敏度、特異性高 設(shè)計合適的引物 SSCP 操作簡便、檢出率不高 選擇合適的片段 RFLP 結(jié)果可靠但限制較多 選擇合適的限制酶 DNA測序 可自動化，但不適宜廣泛使用 與 PCR配合使用生物芯片 效率高，成本高，不適宜廣泛使用選擇合適的芯片目 錄三、 基因診斷技術(shù)路線與方法 n 直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達是否異常n 間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標志與致病基因進行連鎖分析 根據(jù)對致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。錄目 錄目 錄目 錄斑點雜交、反向斑點雜交ASPCR、 PCRSSCP、 錄目 錄在 DNA序列上有一段較長序列的重新排布。 錄目 錄BamHI BamHIα2 α1α2 10 kb14 kbprobe ?珠蛋白生成障礙性貧血 的直接基因診斷?珠蛋白 基因不同程度的缺失可引起不同類型的 ?珠蛋白生成障礙性貧血目 錄 根據(jù)引物 3180。ASPCR（ allelePCR）目 基因表達異常的檢測mRNA長度分析目 錄（二）間接診斷途徑① 致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定② 致病突變機制不清③ 致病位點不便檢測目 2. 遺傳標記目 RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)）② (variableofrepeats)STRtandemSNP(singlepolymorphism)目 HBS的間接基因診斷——RFLP 標記的連鎖分析HapⅠ13kbSouthern印跡雜交N H PN：正常； H：雜合子； P：患者（純合子）；黃色區(qū)域為探針目 錄 第二節(jié) 遺傳病的基因診斷Gene Diagnosis of Hereditary Diseases目 錄一、血紅蛋白?。?hemoglobinopathy） （二） β珠蛋白生成障礙性貧血癥 三、脆性 X綜合征 錄目 目 錄n 正常的（ N）的 ASO探針：