【正文】 芯片,核酸分子雜交,原理： 利用核酸的變性、復性及堿基互補的性質，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中是否存在與探針互補的同源核酸序列，進行DNA或RNA定性定量分析。,表型克隆技術－－是將有關表型與基因結構結合，直接 分離該表型的相關基因，并對疾病相關的一組基因進行 克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。 定位性克隆策略是當前基因診斷的重要基礎。,定位性克?。鶕?jù)遺傳連鎖圖進行定位性克隆。,檢測與某種遺傳標志連鎖的致病基因,遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點，由于位置十分靠近，在遺傳時分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。,基因診斷的基本策略：,檢測已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因,這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改變亦較清楚。 初步認為是個別細胞基因突變而引起的 細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）,后天基因突變引起的疾病,二、基因診斷的對象,（1）用核心順序的串聯(lián)重復序列組成探針進行雜交研 究，可同時檢出具有高度多態(tài)性位點。,先天遺傳性疾病,遺傳性疾病: 發(fā)病的原因為特定基因的突變。,DNA雙螺旋 遺傳密碼破譯 DNA重組 癌基因與抑癌基因研究 地中海貧血病基因治療和逆轉錄病毒載體開發(fā) PCR、分子雜交等一系列技術發(fā)展,二、基因診斷的對象,病原生物的侵入,病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲,檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學方法、基因診斷等。,可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。,穩(wěn)定性高,診斷范圍廣，適應性強,目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。,基因診斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結構變異和表達狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點：,基因診斷的特點：,病因診斷：,直接瞄準病理基因，不僅對表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn) 潛在的致病因素，如: 確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。,第一節(jié) 基因診斷 （DNA diagnosis）,一、基因診斷的概念和基本概況,臨床診斷 生化學診斷 免疫學診斷,臨床疾病診斷四種方式：,以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、 糖尿病、先天畸形等、,三、獲得性基因?。褐竿庠椿颍―NA）侵入， 在機體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。 如：血友病、地中海貧血等。,將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng) 稱為基因病?；蛟\斷和基因治療,南通大學醫(yī)學院生化教研室,沈 勤,概念：,基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會導致各種表型的改變，進而引起疾病的發(fā)生。,基因病分為三大類：,一、單基因?。?由單個基因突變引起的一類疾病。,二、多基因?。河啥鄠€基因突變綜合作用引起的 疾病。 如：艾滋病及各種微生物感染病。 （細胞形態(tài)結構變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識別差異等）,基因診斷,對患者基因直接分析,基因診斷定義（概念）：,基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測患者體內(nèi)基因結構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷。,特異性強、靈敏度高：,選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術。樣品可長期保存。,（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的 診斷技術相比）,基因診斷的基本概況：,伴隨分子生物學理論技術的發(fā)展而建立和發(fā)展。,尤其是當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。,腫瘤的發(fā)生：,發(fā)病機理尚不請。 （2）用southern 雜交得到DNA指紋圖譜,個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證,其他,二、基因診斷的對象,遺傳穩(wěn)定，個體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定。,如：已被克隆的病毒、細菌、霉菌和寄生蟲的基因、 與致病有關的癌基因、抗癌基因、 地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。,染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內(nèi)切酶酶切位點作遺傳 標志，定位與之相連鎖的正常基因與致病基因，建立相應的遺傳連鎖圖譜。比較正常 和異?；虻牟顒e，可找出導致遺傳病的分子缺陷。,檢測表型克隆基因,針對多基因?。ㄈ纾褐囟确逝帧⑾?、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾病）。,該策略既不需預先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受 基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。,基因檢驗的兩個必要條件：,必需的特異探針（標記的） 必需的基因組DNA,核酸分子雜交－－核酸印跡雜交,DNA印跡雜交（ Southern blot） RNA印跡雜交 （Nouthern blot） 斑點印跡雜交 （Dotblot） 原位雜交 (situ hybridization),核酸印跡雜交基本過程：,提取DNA或RNA → 酶切 → 凝膠電泳→ 膠變 性處理（DNA）→ 轉印核酸片段到NC膜上。 探針需要標記可直接檢測的元素或分子。,一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術。,耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶,寡核苷酸引物：設計引物和確定退火溫度是PCR 成功的關鍵。,（呈2n 擴增速度）,PCR基本過程和原理,特點：特異性強 靈敏度高 樣品可以是： 毛發(fā)、血痕 單細胞、 病原體、 腫瘤殘留物、 犯罪現(xiàn)場遺留物,基因診斷中常用的PCR技術：,（1）、DNA PCR：,（2）、RT PCR：,以DNA為模板，擴增特定核苷酸序列。,以總RNA或mRNA為模板，逆轉錄為cDNA后擴增。,（3）、PCRSSCP：,檢測基因未知突變的常用技術。,（4）、多重 PCR：,指在一次PCR反應中加入多對引物，同時擴增DNA 序列上不同序列片段的一種PCR技術。,（5）、原位 PCR：,直接用組織切片和細胞進行PCR或RTPCR，在組織、 細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點基因序列。,其他重要的PCR衍生技術,反向PCR（IPCR）