【正文】 擴(kuò)增后用該限制酶切割 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。RFLP）錄（三） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（ singlestrand錄目 with等位基因特異性寡核苷酸改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率 。blotting）RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過(guò)分子雜交檢測(cè)特定的 mRNA分子的含量與大小。錄n 免疫組織化學(xué)診斷 錄目 錄目 錄第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)Basis of Gene Diagnostics目 基因診斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是 DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。n DNA序列測(cè)定（ DNA錄目 blotting）6.目 熒光定量 PCR熒光標(biāo)記引物目 DNA序列測(cè)定（ DNA錄目 RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)）② SNP(single錄一、血紅蛋白?。?hemoglobinopathy） 目 錄目 2： bA/錄二、血友病（ Hemophilia）n 甲型血友病是由于血漿凝血因子 VIII（FVIII）缺陷造成。錄目 抑癌基因 DPC4和MADR2也可能會(huì)因 18q等位基因丟失而失活。二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷目 一、 DNA指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記目 錄目 2． DNA指紋圖與親權(quán)鑒定 目 定義： 指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，導(dǎo)入的正?；颍灾脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。interference） 定義： 采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。目 能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。錄宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。 快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。DNAREP：病毒復(fù)制基因 ,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對(duì)人類無(wú)致病性。（ 1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖目 1.錄（三）干擾 RNA interference， 目 RISC)。體外化學(xué)合成 。n 苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 錄自殺基因治療基本原理： 向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性地使轉(zhuǎn)染了 “自殺基因 ”的腫瘤細(xì)胞 “自殺 ”。目 錄目 錄目 三月 21三月 2113:18:5913:18:59March 22, 20231意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 三月 211:18 下午 三月 2113:18March 22, 20231業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 三月 21三月 21Monday, March 22, 2023很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒(méi)有。 腺苷酸合成酶等基因，導(dǎo)入細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)，可以激活核酸酶 F， 降解病毒 RNA。 臨床上對(duì)絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。細(xì)胞內(nèi)氧化和解毒作用的酶系統(tǒng)：目 目 激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。腫瘤的免疫基因治療藥物增敏基因治療； 錄研究基因功能的新工具 與一般的反義 RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到 RNA酶的攻擊。錄目 錄（二）核酶 (ribozyme) 受體介導(dǎo)的反義 RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。目 將 DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使 DNA具有靶向性。ofl 靶向性差。錄p LTR由 U R和 U5三部分組成。錄反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（ 1）反轉(zhuǎn)錄病毒 目 HSV） Ⅰ 型胸苷激酶（ thymidine類型 :n 在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；颍?xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；n 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。replacement） 錄親權(quán)鑒定與 DNA指紋圖由此圖可推斷出： A和 C是親生女兒； B為妻子和其前夫所生； D為養(yǎng)女。PI值表示爭(zhēng)議父作為親父比隨機(jī)男人作為親父的可能性大多少倍， PI值大于 1表示傾向肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于0時(shí)表示排除父子關(guān)系 。n 以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血型、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和 HLA分型，個(gè)體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認(rèn)證。length repeat， TR）組成， TR的核心序列同源性很高，等位 HVR的長(zhǎng)度由于 TR的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。bp長(zhǎng)，稱為小衛(wèi)星 DNA。DCC（ deletioncoli）是結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中第一個(gè)突變基因。在癌發(fā)展過(guò)程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。錄目 （ 1） PCRSSCP分析技術(shù)錄目 n 男性和女性攜帶者增多到 52～ 200拷貝，相鄰的 CpG kb三種帶型。bp片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于 200DNA/Msp錄目 GAAGGAG三、脆性 X綜合征 ——RFLP 標(biāo)記的連鎖分析HapⅠ13kbSouthern印跡雜交N H PN：正常； H：雜合子； P：患者（純合子）；黃色區(qū)域?yàn)樘结樐?STR基因表達(dá)異常的檢測(cè)錄基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法 優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題 解決方案核酸分子雜交 結(jié)果可靠但操作繁瑣 選擇合適的探針 PCR 靈敏度、特異性高 設(shè)計(jì)合適的引物 SSCP 操作簡(jiǎn)便、檢出率不高 選擇合適的片段 RFLP 結(jié)果可靠但限制較多 選擇合適的限制酶 DNA測(cè)序 可自動(dòng)化，但不適宜廣泛使用 與 PCR配合使用生物芯片 效率高，成本高，不適宜廣泛使用選擇合適的芯片目 錄A B C D E F G－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－ ＋C +DAEcoR目 目 polymorphism,錄1.錄目 錄熒光原位雜交（ FISH）目 oligonucleotide,錄將 RNA或 DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。blotting)目 錄（一）核酸分子雜交 Nucleichybridization） YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對(duì)一例 α地中海貧血進(jìn)行診斷。目 目 n 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)acid錄目 目 ASO）目 錄目 SSCP）錄目 錄PCRSSCP分析原理示意目 錄目 Ⅰ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化目 錄目 多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。(short錄目 目 AAGTCT錄1.I。bp的片段太小，在 ％的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二） ?珠蛋白生成障礙性貧血癥目 在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。島未被甲基化，稱為前突變（ premutation）。錄三、寄生蟲及衣原體感染n 瘧原蟲 錄（二）結(jié)腸癌 Kras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。of重復(fù)單位 2～ 6目 polymorphism,目 目 多位點(diǎn) VNTR系統(tǒng)和 DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計(jì)算復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別時(shí)匹配概率的計(jì)算影響因素較多，目前尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的最合理的計(jì)算方法。 目 kinase,錄p 兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列 LTR。p 病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因p 5ˊ端 LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ ψ）及剪接供體位點(diǎn) (SD)和剪接受體位點(diǎn) (SA)。l gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；l pol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；l env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 )?！?由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體： 其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號(hào) ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。② 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因 gag、 env和 pol的缺失不影響其他部分的活性。④ 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)； AAVAAV可以高效定點(diǎn)整合至人 19號(hào)染色體的特定區(qū)域 ，并能較穩(wěn)定地存在。這種偶聯(lián)通常通過(guò)多聚陽(yáng)離子（如多聚賴氨酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)。反義 RNA的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題?反義 RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題?專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題 錄錄目 更重要的是，核酶在切斷 mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的 mRNA分子。（ 1）小干擾性 RNA（ siRNA）（ 2） siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，